Снова о чайных цикадках. Удивительные подробности взаимодействия Empoasca (Matsumurasca) onukii Matsuda с чайными листьями

Многие вещества, вносящие вклад в аромат и вкус чая, образуются из менее летучих и более химически стабильных предшественников, содержащихся в побегах чайных растений, при определённых условиях – например, при механическом повреждении. Эти процессы – часть эволюционно сформировавшихся механизмов, обеспечивающих защиту растений от насекомых-вредителей, от патогенных бактерий и грибов и т.д.. Некоторые технологические операции при обработке чайного листа направлены на активацию этих механизмов и высвобождение вкусоароматических веществ (эти вопросы мы затрагивали, например, здесь — https://vk.com/club47905050?w=wall-47905050_15567 ). К огромному сожалению, в чайном рунете этой важнейшей темы избегают с упорством, достойным лучшего применения, и рассматривают чайную технологию крайне узко и однобоко, продолжая пичкать новые и новые поколения любителей чая «степенью ферментации» (будь она проклята).

Взаимодействие между насекомыми и растениями (в том числе чайными), опосредованное летучими веществами растений, исследуется учёными давно, активно и небезуспешно. Реакции растений вызываются как самим механическим повреждением, так и несвойственными здоровым растениям веществами, которые называются элиситорами. Элиситоры могут выполнять сигнальную роль, взаимодействуя с рецепторами на мембранах растительных клеток, распознающими их и запускающими каскад защитных реакций. Причём они могут быть как экзогенными, продуцируемыми насекомыми (например, целиферины), так и эндогенными, образующимися в самом растении при его повреждении (например, инцептины). До некоторой степени это можно уподобить ответу иммунной системы человека на контакт с антигеном и аутоиммунным процессам. Существуют элиситоры, применяющиеся в сельском хозяйстве для повышения устойчивости растений к вредным факторам – например, хитозан, входящий в состав хитиновой оболочки насекомых и клеточных стенок грибов, он не наносит растениям вреда, но стимулирует защитные реакции. Это можно сравнить с вакцинированием (опять-таки до некоторой степени).

Но возможны и другие механизмы действия элиситоров. Так, β-глюкозидаза, которую выделяют некоторые гусеницы, непосредственно взаимодействует с гликозидами, содержащимися в тканях растений, с образованием летучих веществ, которые, в свою очередь, привлекают ос, откладывающих яйца в тела этих гусениц (см. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC42418/ ).

Гераниол – ненасыщенный ациклический спирт, относящийся к монотерпенам (см. рис. 1). Гераниол имеет цветочный запах и широко распространён в растительном мире – он найден в эфирных маслах розы, герани, лимонного сорга (лемонграсса), а также в личи, винограде, цитрусовых и т.д. Обнаружено, что он обладает антибактериальными свойствами и используется растениями для защиты от бактериальных инфекций; гераниол также отпугивает насекомых-вредителей и, напротив, привлекает полезных насекомых, являющихся их естественными врагами – ос-браконид и мух-саркофагид. В растениях гераниол образуется из геранилдифосфата (универсального предшественника всех монотерпенов, изопреновая структура которого создаётся de novo из ацетил-КоА – см. рис. 2 и https://vuzlit.ru/894534/terpeny_klassifikatsiya_zako.. ) при помощи фермента гераниолсинтазы. Гераниолсинтазы выделены из базилика, камфорного дерева, барвинка и других растений. У насекомых гераниол тоже встречается: у медоносных пчёл он играет роль феромона, у жуков-хризомелин из него образуются защитные вещества иридоиды, и т.д.

Гераниол является важным вкусоароматическим компонентом чая – в частности, улунов и красных чаёв. Прекрасно знакомая всем более-менее образованным любителям чая чайная зелёная цикадка Empoasca (Matsumurasca) onukii Matsuda (см. рис. 3), атакуя молодые чайные побеги, значительно повышает содержание гераниола в них. Было бы логично предположить, что это происходит за счёт активации гераниолсинтазы чайных листьев, подобно тому как это происходит с линалоолом, ещё одним важным чайным монотерпеновым спиртом: непрерывное механическое повреждение повышает уровень экспрессии генов двух различных линалоолсинтаз, и увеличение их активности приводит к выбросу линалоола (см. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28764007/ ). Однако учёные из ключевой лаборатории прикладной ботаники провинции Гуандун и ключевой лаборатории молекулярного анализа и генетического улучшения сельскохозяйственных растений Южного Китая выяснили, что дело не в этом. Результаты их работы были опубликованы в конце 2019 г. в журнале «Biomolecules» — https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6995508/ . Полный текст публикации в формате pdf я прикрепляю к посту.

Чжоу Ин и его коллеги обнаружили, что хотя гераниола в чайных листьях, покусанных цикадками, почти на порядок больше, чем в листьях интактных побегов, активность гераниолсинтазы в них не повышается, а даже немного снижается (см. рис. 4). Как же так? Откуда гераниол?

Учёные приготовили из цикадок экстракт и добавили геранилдифосфат в качестве субстрата – и эта реакционная смесь стала продуцировать гераниол. Значит, фермент, способный расщеплять геранилдифосфат с образованием гераниола, содержался в самих цикадках. Но выделить его и установить его структуру было не так-то просто – как вы понимаете, извлечь новый, неизвестный фермент из экстракта измельчённых насекомых, содержащего огромное число белковых веществ, практически нереально.

Вместо этого из цикадок был полностью извлечён весь транскриптом, то есть совокупность всех информационных РНК, и после обратной транскрипции он был полностью расшифрован – нуклеотид за нуклеотидом. Далее в нём были найдены последовательности нуклеотидов, совпадающие с последовательностями нуклеотидов в генах уже известных терпенсинтаз. И наконец, были сконструированы так называемые открытые рамки считывания, то есть цепочки ДНК, способные выступать в качестве генов. Я, конечно, сокращённо излагаю – на самом деле, это гораздо более сложная и увлекательная работа. Ещё недавно такие вещи были возможны лишь теоретически, а сейчас это рядовой метод исследования. Фантастика!

Эти воссозданные в лабораторных условиях гены цикадок были с помощью векторов введены в кишечную палочку и культуру клеток Sf9 (это клеточная линия, полученная из ткани яичек мотылька Spodoptera frugiperda, она используется как своего рода биологическая машина по наработке белков, гены которых внедряются в эти клетки бакуловирусными векторами). И затем уже исследовали гераниолсинтазную активность полученного белка. Кроме того, в этой работе были проанализированы терпенсинтазы других насекомых и построено их филогенетическое древо, и оказалось, что гераниолсинтаза чайных цикадок сильно отличается от аналогичных ферментов других насекомых, но к чаю это уже не имеет отношения.

Помимо гераниолсинтазы, в чайных зелёных цикадках были обнаружены бактерии Acinetobacter johnsonii. Бактерии рода Acinetobacter – широко распространённые эндосимбионты насекомых. Бактерии-эндосимбионты играют важную роль в адаптации насекомых к окружающей среде: они помогают насекомым усваивать пищу, расщеплять факторы защиты растений, влияют на их размножение. Некоторые Acinetobacter способствуют устойчивости вредителей к инсектицидам. Но роль Acinetobacter johnsonii в организме чайных зелёных цикадок пока неясна.

И оказалось, что гераниол эффективно подавляет рост Acinetobacter johnsonii. Но вот зачем цикадкам выделять фермент, при контакте которого с содержащимся в листьях чая геранилдифосфатом образуется гераниол, подавляющий рост живущих в них и, по идее, нужных им бактерий – пока непонятно, нужны дальнейшие исследования. Но чайное растение явно смогло хорошо приспособиться к этому – ведь его собственная гераниолсинтаза при атаке цикадок не активируется.

В качестве резюме: при нападении зелёных цикадок наряду с активацией ферментов чайного растения, ответственных за высвобождение вкусоароматических веществ (как в случае с линалоолом), имеет место и воздействие ферментов самих цикадок, также влияющее на химический состав, аромат и вкус чая. Так что, как бы безграмотно ни звучало попадающееся в рунете выражение «ферментация слюнями цикадок прямо на кусту», нечто подобное действительно происходит. Только не надо забывать, что всё это касается лишь нюансов вкуса и аромата, выраженности отдельных их оттенков. Хотя описанное выше чрезвычайно увлекательно, Дун Фан Мэй Жэнь производят не эмпоаски-мацумураски, а люди, и в своих главных чертах вкусоароматический профиль Пэн Фэнов – результат технологии, которую мы описывали в посте https://vk.com/club47905050?w=wall-47905050_12039 , а не хитроумных шахматных партий между растениями и насекомыми, фигурами в которых являются гены, ферменты и их субстраты.

Рис.1. Гераниол.

Рис.2. Биосинтез гераниола. GPP – геранилдифосфат, он же геранилпирофосфат, IPP – изопентенилпирофосфат, DMAPP – диметилаллипирофосфат.

Рис. 3. Empoasca (Matsumurasca) onukii Matsuda – чайная зелёная цикадка.

Рис. 4. Продукция гераниола (слева) и активность гераниолсинтазы (справа). CK – контроль, то есть нетронутые цикадками побеги, Insect – повреждённые цикадками побеги чайных растений.