Немного о биохимии уишаньских улунов

Краткий обзор нескольких интересных научных публикаций. В постах – только самое основное, подробности – по ссылкам, часть статей прикреплена к постам в формате pdf.

«Профилирование метаболитов 14 культиваров Уи Янь Ча путём UPLC-QTOF-MS и UPLC-QqQ-MS в сочетании с хемометрией», журнал «Molecules», 24.01.2018 г. – pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… . Факультет садоводства Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства.

Исследовались необработанные листья 14 культиваров – Да Хун Пао (DHP), Те Лоханя (TLH), Бай Цзи Гуаня (BJG), Шуй Цзинь Гуй (SJG), Бань Тянь Яо (BTY), Шуйсяня (SX), Жоу Гуй (RG), Бэй Доу (BD), Цюэ Шэ (QS), Сяо Е Мао Се (XYMX), Цзинь Фэнхуана (JFH), Ай Цзяо Улуна (AJWL), Гуа Цзы Цзиня (GZJ) и «Цзинь Суоши» (JSS) – вероятно, Цзинь Яоши, «Золотого ключика». Был проведён нецелевой анализ метаболомики с помощью ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с квадрупольно-времяпролётной масс-спектрометрией (UPLC‐QTOF‐MS), содержание катехинов, кофеина, рутина и свободных аминокислот определялось с использованием ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии-трёхквадрупольной масс-спектрометрии (UPLC-QqQ-MS).

Большинство из 49 основных метаболитов были обнаружены во всех культиварах. Однако в содержании флаван-3-олов, проантоцианидинов, флавонолгликозидов, флавонгликозидов, флавононгликозидов, производных фенольных кислот, гидролизуемых танинов, алкалоидов и аминокислот между культиварами были обнаружены значительные различия (см. рис. 1). При анализе главных компонентов (PCA) лишь Жоу Гуй и Бань Тянь Яо показали близкую агрегацию, все остальные культивары были чётко разделены (см. рис. 2). Наиболее важными для различения культиваров оказались катехины и гликозидные производные двух флавонолов – кверцетина и кемпферола.

Было идентифицировано 10 флаван-3-олов: галлокатехин, эпигаллокатехин, катехин, эпикатехин, эпигаллокатехингаллат (ЭГКГ), 8-C-аскорбилэпигаллокатехин-3-галлат, эпигаллокатехин-3-(3-O-метил)-галлат (ЭГКГ-3″-Ме), эпикатехингаллат, эпикатехин-3-(3-O-метил)-галлат (ЭКГ-3″-Ме) и эпиафзелехин-3-галлат. Содержание главного чайного катехина – ЭГКГ варьировало от 66,93 мг/г в Бай Цзи Гуане до 128,08 мг/г в Цзинь Фэнхуане. Содержание ЭГКГ-3″-Ме, метилированного катехина, часто встречающегося в улунах и привлекающего внимание учёных своей высокой противоаллергической активностью, в Те Лохане, Бай Цзи Гуане и Цзинь Фэнхуане превышало 6 мг/г, а в Бань Тянь Яо достигало 12,05 мг/г; в то же время, в Шуй Цзинь Гуй, Бэй Доу, Цюэ Шэ, Сяо Е Мао Се и Ай Цзяо Улуне оно было исчезающе малым – от 0,03 до 0,13 мг/г; сходным было и распределение ЭКГ-3″-Ме.

Цзинь Фэнхуан имел интересную особенность: во всех остальных культиварах преобладали гликозиды, в которых кемпферол и кверцетин и связаны с тремя углеводными остатками – кемпферол-3-O-галактозилрутинозид, кемпферол-3-O-глюкозилрутинозид, кверцетин-3-O-галактозилрутинозид и кверцетин-3-O-глюкозилрутинозид, а в Цзинь Фэнхуане они были едва обнаружимы, зато было много гликозидов с двумя углеводными остатками – кемпферол-3-O-рутинозида и кверцетин-3-O-рутинозида, он же рутин, известный своими противовоспалительными и противомикробными эффектами (см. рис. 3). Рутина в Цзинь Фэнхуане было аж 5,40 мг/г, тогда как в остальных культиварах – от 0,18 до 0,89 мг/г. Очевидно, в Цзинь Фэнхуане гликозилтрансферазы, ответственные за гликозилирование флавонолдигликозидов, либо не функционируют, либо экспрессируются на крайне низком уровне.

Аминокислот было обнаружено 18. Как и ожидалось, теанин был преобладающей аминокислотой, составляя от 42,3 до 72,3% от общего количества свободных аминокислот, за единственным исключением: в Бэй Доу содержание глутамата оказалось в полтора раза выше, чем теанина – 1,2 мг/г против 0,8 мг/г. И общее содержание аминокислот в Бэй Доу было самым низким – всего лишь 3,11 мг/г. А рекордсменами по уровню теанина были Бай Цзи Гуань (14,32 мг/г, что и понятно – это ведь полуальбинос, только не термочувствительный, как Бай Е И Хао, из которого делают Аньцзи Бай Ча, и большинство его новых собратьев, а светочувствительный), Шуй Цзинь Гуй (12,08 мг/г) и Цюэ Шэ (11,63 мг/г). В них также было много глутамата и аспартата.

Существенно различалось и содержание кофеина: от 1,38% в Цзинь Фэнхуане до 2,98% в Шуй Цзинь Гуй. В Шуй Цзинь Гуй также было больше теобромина, чем в прочих культиварах, на втором месте по теобромину – Бань Тянь Яо.

Как видите, состав листьев разных уишаньских культиваров далеко не одинаков, и у многих из них есть свои биохимические «фишки», выделяющие их из общего ряда: Бань Тянь Яо богат метилированными катехинами, Цзинь Фэнхуан – рутином, Бай Цзи Гуань – кладезь теанина, Бэй Доу, наоборот, очень беден им, Шуй Цзинь Гуй – самый бодрящий, и так далее.

***

От ботаники – к терруару. «Анализ волатиломики и макросостава первичных Уи Янь Ча из культиваров Жоу Гуй и Шуйсянь из разных зон производства», журнал «Plants», 9.08.2024 г. – pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… . Аньсийский факультет чайной науки и факультет садоводства Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства.

Волатиломика – изучение летучих соединений, в данном случае имеется в виду их совокупность. А первичный Уи Янь Ча – полуфабрикат после первичной обработки, включающей сбор, завяливание, выделку зелени, шацин, сминание и сушку, и до хунбэя. При прогреве на углях состав чая значительно изменяется, и характер и степень этих изменений зависят от силы и продолжительности прогрева. Состав чая до хунбэя более корректно отражает ботанические и терруарные особенности.

Фуцзяньские учёные исследовали состав и свойства таких недоделанных Жоу Гуй из зон чжэнъянь, баньянь, высокогорной и вайшань (ZR, BR, GR и WR соответственно) и Шуйсяня из этих же зон (ZS, BS, GS и WS), от одного и того же производителя. Сенсорную оценку образцов проводила группа профессиональных дегустаторов, уровень летучих соединений определяли с помощью твёрдофазной микроэкстракции в парофазном пространстве и газовой хроматографии с масс-спектрометрией (HS-SPME-GC-MS).

Дегустаторы оценивали по десятибалльной шкале пять характеристик аромата (выраженность цветочного, фруктового, древесного, свежего и сладкого аромата) и пять характеристик вкуса (мягкость, густоту/насыщенность, вяжущий вкус, горечь и умами) – см. рис. 5. Бросается в глаза принципиальная разница ароматических профилей Жоу Гуй и Шуйсяня: у Жоу Гуй силён цветочный аромат, а древесный слаб, у Шуйсяня – наоборот. Выраженность цветочного аромата у обоих культиваров уменьшалась в ряду чжэнъянь – высокогорный район – баньянь – вайшань, сладкого – в несколько отличающейся последовательности: чжэнъянь – баньянь – высокогорный район – вайшань. По свежему аромату Шуйсяни из разных зон производства существенно не отличались, а среди Жоу Гуй интенсивность свежего аромата была выше всего у образцов из высокогорного района, затем следовали зоны баньянь, чжэнъянь и вайшань. Что же касается вкуса, то в целом, настоящие утёсные Шуйсяни и Жоу Гуй набрали максимальные баллы по всем пяти шкалам (но горечь и вяжущий вкус и у них имели невысокую интенсивность), за ними следовали полуутёсные, высокогорные и внешние чаи.

Всего было идентифицировано 680 летучих соединений, которые присутствовали во всех образцах, но в разных количествах; таким образом, терруар влияет не на качественный состав, а на уровень летучих соединений и их баланс. Суммарное содержание ЛВС в Жоу Гуй было заметно выше, чем в Шуйсяне. Как у Жоу Гуй, так и у Шуйсяня общее содержание ЛВС в образцах из зон чжэнъянь, гаошань и баньянь было намного выше, чем в образцах из зоны вайшань. Но у Жоу Гуй настоящие утёсные образцы значительно превосходили высокогорные и полуутёсные по этому показателю, а у Шуйсяня статистически значимых различий между этими тремя классами не было (см. рис. 5).

Затем путём дискриминантного анализа с использованием метода частичных наименьших квадратов (PLS-DA) были определены дифференциальные соединения – то есть те, различия в уровнях которых наиболее велики, что позволяет отличить одну группу образцов от другой. Для Жоу Гуй летучими соединениями с наибольшей важностью были индол, 2-метил-7-экзо-винилбицикло[4.2.0]окт-1(2)-ен, (Z)-3-гексенилгексаноат, 2-нитроэтилбензол, 5-гексенилгексаноат, хотриенол, 1,3-диоксолан-2,2-диэтанол, бета-фенилэтилбутират, н-бутилбензол и 3,7-диметил-2,6-октадиенилбутират. Для Шуйсяня – индол, 2-метил-7-экзо-винилбицикло[4.2.0]окт-1(2)-ен, н-бутилбензол, 1-этенил-1,5-диметил-4-гексенилпентаноат, 2-нитроэтилбензол, (Z)-3-гексенилгексаноат, 1-метил-4-(1,2,2-триметилциклопентил)циклогекса-1,3-диен, α-булнезен, 1,3-диоксолан-2,2-диэтанол и бензиловый спирт. Содержание практически всех этих веществ было наибольшим в чжэнъянь ча и наименьшим – в вайшань ча.

Проанализировав корреляцию между сенсорными ароматическими профилями образцов и содержанием дифференциальных ЛВС с OAV (значение активности запаха, показывающее, во сколько раз концентрация вещества выше порога его обнаружения) >1, учёные установили, что наибольший вклад в цветочный, сладкий и фруктовый аромат первичной Жоу Гуй вносят 2-метилпропилпиразин, (Z)-3-гексенилгексаноат, транс-сабиненгидрат, 2-фенилэтилацетат, бензиловый спирт, хотриенол, 2-метилгексилбутират, 2-нитроэтилбензол и геранилизобутират; есть ещё несколько менее значимых веществ. Профиль первичного Шуйсяня беднее и образован только шестью ЛВС: бензиловым спиртом, хотриенолом, бензальдегидом, 2-метилгексилбутиратом, 2-нитроэтилбензолом и геранилизобутиратом.

Общее содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, в Жоу Гуй было выше, чем в Шуйсяне. И у Жоу Гуй, и у Шуйсяня оно снижалось в ряду чжэнъянь – баньянь – высокогорный район – вайшань, что соответствует сенсорной оценке: настоящие утёсные образцы обладали наибольшей густотой/насыщенностью, а вайшань ча – наименьшей (см. рис. 6).

В такой же последовательности – чжэнъянь – баньянь – гаошань – вайшань – убывало общее содержание свободных аминокислот и кофеина, но при этом в Шуйсянях их было больше, чем в Жоу Гуй из аналогичных зон.

Общее содержание полифенолов у Жоу Гуй и Шуйсяня оказалось близким, и у вайшань ча оно было существенно ниже, чем у настоящих утёсных, полуутёсных и высокогорных чаёв.

Общее содержание флавоноидов было примерно одинаковым во всех группах образцов.

По общему содержанию растворимых сахаров лидировали высокогорные чаи, а также вайшань Жоу Гуй.

Различия в содержании водорастворимых пигментов – теафлавинов, теарубигинов и теабраунинов были неоднозначными, и их вряд ли можно использовать для различения Уи Янь Ча из разных зон производства.

Таким образом, представления о разном уровне качества и разной ценности настоящих утёсных, полуутёсных, высокогорных и внешних уишаньских улунов имеют под собой бесспорную материальную основу: в чжэнъянь ча попросту выше содержание веществ, отвечающих за вкус и аромат, а в вайшань ча – ниже.

Рис. 1. «Тепловая карта» содержания 49 метаболитов в листьях четырнадцати уишаньских культиваров. DHP – Да Хун Пао, TLH – Те Лохань, BJG – Бай Цзи Гуань, SJG – Шуй Цзинь Гуй, BTY – Бань Тянь Яо, SX – Шуйсянь, RG – Жоу Гуй, BD – Бэй Доу, QS – Цюэ Шэ, XYMX – Сяо Е Мао Се, JFH – Цзинь Фэнхуан, AJWL – Ай Цзяо Улун, GZJ – Гуа Цзы Цзинь, JSS – Цзинь Яоши.

Рис. 2. Анализ главных компонентов (PCA) метанольных экстрактов листьев четырнадцати уишаньских культиваров. DHP – Да Хун Пао, TLH – Те Лохань, BJG – Бай Цзи Гуань, SJG – Шуй Цзинь Гуй, BTY – Бань Тянь Яо, SX – Шуйсянь, RG – Жоу Гуй, BD – Бэй Доу, QS – Цюэ Шэ, XYMX – Сяо Е Мао Се, JFH – Цзинь Фэнхуан, AJWL – Ай Цзяо Улун, GZJ – Гуа Цзы Цзинь, JSS – Цзинь Яоши.

Рис. 3. Средние значения пиковой площади гликозидов кверцетина (A) и гликозидов кемпферола (B) в листьях четырнадцати уишаньских культиваров. DHP – Да Хун Пао, TLH – Те Лохань, BJG – Бай Цзи Гуань, SJG – Шуй Цзинь Гуй, BTY – Бань Тянь Яо, SX – Шуйсянь, RG – Жоу Гуй, BD – Бэй Доу, QS – Цюэ Шэ, XYMX – Сяо Е Мао Се, JFH – Цзинь Фэнхуан, AJWL – Ай Цзяо Улун, GZJ – Гуа Цзы Цзинь, JSS – Цзинь Яоши.

Рис. 4. Сенсорная оценка первичных Уи Янь Ча из разных зон производства. А – внешний вид, В – аромат, С – вкус. ZR – чжэнъянь Жоу Гуй, BR – баньянь Жоу Гуй, GR – гаошань Жоу Гуй, WR – вайшань Жоу Гуй, ZS – чжэнъянь Шуйсянь, BS – баньянь Шуйсянь, GS – гаошань Шуйсянь, WS – вайшань Шуйсянь.

Рис. 5. Общее содержание летучих соединений в первичных Уи Янь Ча из разных зон производства. ZR – чжэнъянь Жоу Гуй, BR – баньянь Жоу Гуй, GR – гаошань Жоу Гуй, WR – вайшань Жоу Гуй, ZS – чжэнъянь Шуйсянь, BS – баньянь Шуйсянь, GS – гаошань Шуйсянь, WS – вайшань Шуйсянь.

Рис. 6. Содержание экстрактивных веществ в первичных Уи Янь Ча из разных зон производства. ZR – чжэнъянь Жоу Гуй, BR – баньянь Жоу Гуй, GR – гаошань Жоу Гуй, WR – вайшань Жоу Гуй, ZS – чжэнъянь Шуйсянь, BS – баньянь Шуйсянь, GS – гаошань Шуйсянь, WS – вайшань Шуйсянь.

Metabolite Profiling of 14 Wuyi Rock Tea Cultivars Using UPLC-QTOF MS and UPLC-QqQ MS Combined with Chemometrics.pdf

Volatilomics and Macro-Composition Analyses of Primary Wuyi Rock Teas of Rougui and Shuixian Cultivars from Different Product...pdf

ЧАСТЬ 2

Ещё одна похожая работа, выполненная всё тем же факультетом садоводства Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства. «Нецелевой метаболомный анализ выявил характерные нелетучие и летучие метаболиты в Уи Жоу Гуй из разных регионов культивирования», журнал «Foods», 9.06.2022 г. – www.mdpi.com/2304-8158/… .

Здесь исследовались образцы Уи Жоу Гуй, прошедшие полный цикл обработки по одинаковой технологии на одной и той же фабрике, из трёх локаций – Матоуянь (Гуйпи Сян Жоу Гуй – с коричным ароматом), Хуэйюанькэн (Хуа Го Сян Жоу Гуй – с цветочно-фруктовым ароматом) и деревня Синцунь за пределами Живописного района Уи. Профессиональные дегустаторы оценивали по десятибалльной шкале уровень пяти вкусовых (мягкость, горечь, умами, терпкость и густота) и пяти ароматических (цветочный, фруктовый, древесный, жареный и острый аромат) показателей. Нелетучие метаболиты изучали с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS), летучие – с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрией (GC-MS).

Настой всех образцов был ярким, оранжево-красным (так в оригинале; лично я назвал бы этот цвет красновато-оранжевым), у синцуньской Жоу Гуй – темнее, у матоуяньской и хуэйюанькэнской – более прозрачным. Пряный аромат присутствовал во всех образцах, но у Гуйпи Сян Жоу Гуй он был более очевидным и стойким. Фруктовый аромат был заметным в Гуйпи Сян Жоу Гуй и в Хуа Го Сян Жоу Гуй, а цветочный – только в Хуа Го Сян Жоу Гуй. Вкус синцуньской Жоу Гуй был тяжёлым и мягким, а у настоящих утёсных образцов – густым, сладким и свежим, у Хуа Го Сян Жоу Гуй – с цветочным тоном (см. рис. 1).

Было идентифицировано 519 нелетучих метаболитов, из них дифференциальных (то есть значимых для различения образцов) – 24 (см. рис. 2): шесть аминокислот и их производных, семь органических кислот, три флавоноида, три терпеноида, три нуклеотидных кислоты и два алкалоида. Содержание L-аргинина, L-аспарагиновой кислоты, L-лизина, силибинина, эпоксида кариофиллена и рутина в матоуяньских и хуэйюанькэнских образцах было выше, чем в синцуньских. А в синцуньской Жоу Гуй было выше содержание четырёх органических кислот (фумаровой, троповой, глицериновой и сиреневой), двух нуклеотидных кислот (гуанина и цитозина) и дигидрокапсаицина. Кроме того, в Гуйпи Сян Жоу Гуй были значительно выше уровни зерумбона (один из жгучих компонентов тропического имбиря) и периллилового спирта (содержится в мяте перечной, шалфее, лемонграссе и др.) по сравнению с Хуа Го Сян Жоу Гуй и с синцуньской.

Летучих соединений было выделено 90, из них 81 компонент был обнаружен в Гуйпи Сян Жоу Гуй и в Хуа Го Сян Жоу Гуй, а в синцуньских образцах – лишь 61. В синцуньской и в хуэйюанькэнской Жоу Гуй основную долю составляли альдегиды (35,05% и 25,89% соответственно). На втором и третьем месте в синцуньском чае были ароматические соединения (15,67%) и спирты (10,37%), а в хуэйюанькэнском – спирты (13,61%) и терпены (13,42%). В матоуяньской Жоу Гуй доля альдегидов (19,25%) была ниже, а спиртов (19,24%) и терпенов (19,00%) – выше по сравнению с Жоу Гуй из других зон.

Ведущим летучим соединением в синцуньской Жоу Гуй был пентаналь, за которым следовали п-ксилол, толуол, N-этилпиррол и 1-пентен-3-ол, а также 2-метилбутиральдегид. В настоящих утёсных Жоу Гуй содержание 2-метилбутиральдегида было максимальным. Помимо него, в Хуа Го Сян Жоу Гуй доминировали N-этилпиррол, 1-пентен-3-ол, 2-этилфуран, гексадекан и 3-метилбутиральдегид, а в Гуйпи Сян Жоу Гуй в большом количестве присутствовали дегидролиналоол, D-лимонен, 1-пентен-3-ол, (Z)-α-α-5-триметил-5-винилтетрагидрофуран-2-метанол, β-пинен и толуол.

Соединений со значением активности запаха (OAV) не меньше единицы (то есть таких, содержание которых превышало порог обнаружения человеческим обонянием) было выявлено 24. 16 из них имели наибольшую статистическую значимость – это 1-пентен-3-ол, 1-октен-3-ол, дегидролиналоол, 3-метилбутиральдегид, адипальдегид, (Z)-4-гептеналь, шафрановый альдегид, β-циклоцитраль, 3-карен, 2-карен, α-пинен, D-лимонен, β-родулен, (E)-β-базилен, β-пинен и 6-метил-5-гептен-2-он; можно сказать, что они и формируют характерный ароматический облик Уи Жоу Гуй. При этом линалоол, 2-метилбутиральдегид, адипальдегид, фенилацетальдегид, β-циклоцитраль, 3-гексенил-(Z)-капронат, гексилгексаноат, D-лимонен, α-фарнезен, β-пинен, толуол и 6-метил-5-гептен-2-он имели OAV ≥1 во всех образцах, пентаналь с фруктовым и жареным запахом – только в синцуньской, шафрановый альдегид с древесным и шафрановым запахом – только в хуэйюанькэнской, 1-октен-3-ол с цитрусовым запахом – только в матоуяньской.

При дискриминантном анализе с использованием метода частичных наименьших квадратов (PLS-DA) Жоу Гуй из разных зон производства чётко разделялись по летучим компонентам (см. рис. 3).

Таким образом, различия в содержании вкусоароматических соединений велики не только между Жоу Гуй разных категорий – чжэнъянь, баньянь и вайшань. Настоящие утёсные Жоу Гуй из локаций с отличающимся рельефом и микроклиматом также имеют разный баланс соединений, влияющих на вкус и/или аромат, как летучих, так и нелетучих. Причём многие наблюдаемые органолептические явления находят своё объяснение при внимательном анализе состава чая: например, более высокое содержание витексина, дигидрокапсаицина и органических кислот обеспечивает густоту синцуньской Жоу Гуй, а L-аспарагиновая кислота и о-сукцинил-L-гомосерин ответственны за мягкость и умами настоящих утёсных Жоу Гуй. Более подробный разбор – в первоисточнике, полный текст публикации прикреплён к посту в формате pdf.

***

Можно ли использовать эти различия для географической идентификации Жоу Гуй? Да, хотя и не с абсолютной точностью. «Метаболомика, интегрированная с машинным обучением, позволяет определить географическое происхождение Уи Жоу Гуй», журнал «NPJ Science op Food», 16.03.2023 г. – pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… . Научная база всё та же – но с участием Научно-технологического института Хайся, у них с Фуцзяньским университетом сельского и лесного хозяйства есть совместный центр садоводческой биологии и метаболомики.

Фуцзяньские учёные взяли 333 образца Жоу Гуй. 174 – из «основного района производства», то есть из Живописного района Уи и 159 – из «неосновного района производства»: из уезда Уишань, но не из Живописного района; из уезда Пучэн, уезда Цзяньоу и района Цзяньян округа Наньпин; из уездов Цзяньнин, Тайнин, Юнъань и Датянь округа Саньмин (см. рис. 4). Летучие соединения идентифицировались при помощи твёрдофазной микроэкстракции и газовой хроматографии с времяпролётной масс-спектрометрией (SPME-GC-TOF-MS). После применения иерархического кластерного анализа для удаления выбросов было оставлено 276 образцов.

На графике анализа главных компонентов (PCA) кластеризация образцов из основного и неосновного района была недостаточной. Ортогональный метод частичных наименьших квадратов с дискриминантным анализом (OPLS-DA) дал лучшие результаты (см. рис. 5).

Было выявлено 111 соединений, содержание которых в Жоу Гуй из основного района отличалось от их содержания в чае из неосновного района (у 57 в бóльшую сторону, у 54 – в меньшую). Статистически значимыми были 20 из них: 6 сложных эфиров, 6 углеводородов, 3 кетона, 3 спирта, 2 гетероциклических соединения и 1 неустановленное вещество (см. рис. 6).

В Жоу Гуй из основного района было выше содержание летучих веществ с цветочными, фруктовыми и древесными ароматами – хотриенола, α- терпинеола и 4-метил-3-пентен-2-она. Кроме того, больше было 2-ацетилпиррола – продукта реакции Майяра, имеющего орехово-хлебный аромат, а также нескольких разветвлённых алканов – 2,3,6,7-тетраметилоктана, 4,6-диметилдодекана, 2,3,5,8-тетраметилдекана и 4-этилтетрадекана, которые образуются при термическом разложении терпенов – но это обусловлено нагревом при обработке чая и с географией связано лишь опосредованно.

Напротив, сложные эфиры с фруктовыми и зеленушными ароматами – гексил-2-метилбутират, гексилгексаноат, транс-2-гексенилкапроат и β-фенилэтилбутират – в большей концентрации обнаруживались в образцах из неосновного района. Также в них было больше 5,6-эпокси-β-ионона (фруктовый и цветочный аромат) и этилизопропилкетона (мятный аромат).

Затем исследователи разделили 276 образцов на обучающий (220) и тестовый (56) наборы и оценили эффективность пятнадцати (!) разных алгоритмов машинного обучения, используя 176 метаболических показателей. Наилучшие результаты продемонстрировал многослойный персептрон (MLP) – разновидность искусственной нейронной сети прямого распространения, его предсказательная точность достигла 92,7% для обучающего набора и 91,1% для тестового (см. рис. 7). Затем он был проверен ещё раз на наборе из 17 образцов Жоу Гуй, приобретённых на рынке – их происхождение было определено с точностью 94,1%.

Напоследок авторы работы повторили этот этап с сокращённым набором данных, взяв только 30 наиболее значимых метаболических показателей – ради сокращения затрат вычислительных мощностей. В этих условиях эффективность многослойного персептрона значительно снизилась – предсказательная точность упала до 83,2% для обучающего набора и ниже 80% для тестового. А наилучшие результаты показал градиентный бустинг (GB) – 87,5%.

***

Гораздо более высокой точности (97,7%!) при различении уишаньских и не уишаньских образцов Жоу Гуй удалось добиться учёным из ключевой лаборатории биометрологии, инспекции и карантина провинции Чжэцзян при факультете естественных наук Китайского университета Цзилян (г. Ханчжоу), причём было это ещё в 2017 г. – pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… . Но они использовали не метаболомный анализ, а анализ соотношения стабильных изотопов (SIR) и профилирование металлических элементов (MEP) с использованием метода опорных векторов (SVM). А это существенно сложнее, дороже и требует больших затрат времени.

Рис.1. Вкусовые (слева) и ароматические (справа) профили Уи Жоу Гуй из разных зон производства. RG – синцуньская Жоу Гуй, HGRG – хуэйюанькэнская Хуа Го Сян Жоу Гуй, GPRG – матоуяньская Гуйпи Сян Жоу Гуй.

Рис. 2. «Тепловая карта» 24 дифференциальных нелетучих метаболитов в Уи Жоу Гуй из разных зон производства. RG – синцуньская Жоу Гуй, HGRG – хуэйюанькэнская Хуа Го Сян Жоу Гуй, GPRG – матоуяньская Гуйпи Сян Жоу Гуй.

Рис. 3. Разделение Уи Жоу Гуй из разных зон производства при помощи анализа 90 летучих соединений. RG – синцуньская Жоу Гуй, HGRG – хуэйюанькэнская Хуа Го Сян Жоу Гуй, GPRG – матоуяньская Гуйпи Сян Жоу Гуй. A – дискриминантный анализ с использованием метода частичных наименьших квадратов (PLS-DA), B – график теста перестановки, C – дифференциальная значимость летучих компонентов в порядке убывания.

Рис. 4. География отбора образцов Жоу Гуй. CRT – основной район производства, NCRT – неосновной район производства.

Рис. 5. Многомерный статистический анализ летучих соединений в образцах Жоу Гуй из основного (CRT) и неосновного (NCRT) района производства. Слева (a) – анализ главных компонентов (PCA), справа (b) – ортогональный метод частичных наименьших квадратов с дискриминантным анализом (OPLS-DA).

Рис. 6. Различия в содержании летучих соединений в образцах Жоу Гуй из основного (CRT) и неосновного (NCRT) района производства.

Рис. 7. Предсказательная точность пятнадцати алгоритмов машинного обучения при различении Жоу Гуй из основного и неосновного района производства на основании полного (176) и сокращённого (30) набора метаболических показателей (для обучающего набора).

Non-Targeted Metabolomics Analysis Revealed the Characteristic Non-Volatile and Volatile Metabolites in the Rougui Wuyi Rock...pdf

Metabolomics integrated with machine learning to discriminate the geographic origin of Rougui Wuyi rock tea.pdf

Stable Isotope Ratio and Elemental Profile Combined with Support Vector Machine for Provenance Discrimination of Oolong Tea (...pdf

ЧАСТЬ 3

Перейдём от Жоу Гуй к Шуйсяню. «Широкомасштабный метаболомный анализ различных Уи Шуйсяней и ассоциация со вкусовыми характеристиками», журнал «Heliyon», 05.08.2023 г. – pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… . Всё тот же факультет садоводства Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства.

Исследовались три образца Лао Цун Шуйсяня и один образец обычного Шуйсяня, приобретённые на уишаньском рынке. Мягкость, сладость, умами, горечь, терпкость и кислый вкус оценивались по шкалам от 0 до 9 группой из семи профессиональных дегустаторов. Общая органолептическая оценка складывалась из оценок внешнего вида сухого чая (20%), аромата (30%), вкуса (35%), цвета настоя (5%) и «чайного дна» (10%) по 100-балльным шкалам.

Вкус всех Лао Цун Шуйсяней оказался более мягким, чем у обычного Шуйсяня. У обычного Шуйсяня по сравнению с Лао Цун Шуйсянями был значительно сильнее выражен кислый вкус; его вкус также был горьким и терпким, но по этим показателям один из образцов Лао Цун Шуйсяня был с ним сопоставим. Сладость и умами у всех образцов были близкими (см. рис. 1). Общая оценка Лао Цун Шуйсяней – 94,3, 93,2 и 90,4 балла, обычного Шуйсяня – лишь 86,4.

Путём ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (UPLC-MS) с линейной ионной ловушкой (LIT) и тройным квадруполем (QQQ) было идентифицировано и количественно оценено 692 нелетучих метаболита 133 классов. При анализе главных компонентов (PCA) все образцы кластеризовались отдельно, но Лао Цун Шуйсяни №1 и №2 были близки; все Лао Цун Шуйсяни оказались в правой половине графика, а обычный Шуйсянь – в левой (см. рис. 2).

Для определения дифференциальных метаболитов использовали ортогональный метод частичных наименьших квадратов с дискриминантным анализом (OPLS-DA). В Лао Цун Шуйсяне №1 статистически значимо отличались от обычного Шуйсяня 30 показателей, в Лао Цун Шуйсяне №2 – 29 (и 20 из них совпадали у №1 и №2). Лао Цун Шуйсянь №3 был ближе к обычному Шуйсяню – 21 дифференциальный метаболит – и дальше от №1 и №2 (по 10 совпадающих). Лао Цун Шуйсяни №1 и №2 содержали в 2,5 раза больше цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислоты и в 1,5 раза больше 8,15-дигидроксиэйкоза-5,9,11,13-тетраеновой кислоты, чем обычный Шуйсянь, а содержание генистина и О-гликозида п-кумаровой кислоты было значительно ниже. В Лао Цун Шуйсяне №3 по сравнению с обычным Шуйсянем уровень эйкозеновой кислоты был выше в 2,4 раза, уровень 8,15-дигидроксиэйкоза-5,9,11,13-тетраеновой кислоты – выше в 1,4 раза, а уровни генистина и цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислоты отличались в меньшую сторону. В целом, в обычном Шуйсяне было больше фенольных кислот и их производных, дающих кислый вкус – кофейной кислоты, N-ферулоилпутресцина, 1-O-[(E)-п-кумароил]-β-d-глюкопиранозы, O-гексозида 3-O-п-кумароилшикимовой кислоты и O-гликозида п-кумаровой кислоты, и больше флавоноидов, дающих горечь и терпкость – кемперфина, генистина, 3-гликозидов кверцетина, 3,7-ди-O-метилкверцетина. В Лао Цун Шуйсянях было больше полиненасыщенных жирных кислот, затрудняющих восприятие горечи и терпкости, а также кумарина, содержание которого в листьях увеличивается с возрастом растений (не только чайных).

При помощи анализа взвешенных сетей коэкспрессии генов (WGCNA) были установлены 18 ключевых биомаркеров, наиболее перспективных для различения Лао Цун Шуйсяня и обычного Шуйсяня (см. рис. 3).

Минус этой работы – крошечная выборка: всего четыре образца. Тем не менее, она представляет определённый интерес. Показательно, что рассматривались только нелетучие метаболиты – вот насколько у Шуйсяня баланс информативности смещён в сторону вкуса по сравнению с Жоу Гуй, где более значим аромат. И неожиданна такая большая роль полиненасыщенных жирных кислот – исследователи чая нечасто обращают на них внимание.

***

Ещё одна любопытная работа. «Изучение характерных летучих веществ в Уи Янь Ча из разных культиваров при помощи хемометрии и газовой хроматографии-ольфактометрии/масс-спектрометрии», журнал «Foods», 19.12.2009 г. – pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… . Научно-исследовательский институт чая Китайской академии сельскохозяйственных наук (г. Ханчжоу).

Исследовались образцы Да Хун Пао, Жоу Гуй, Шуйсяня и Цзинь Фо от одного и того же производителя, по четыре партии каждого сорта. Было идентифицировано 166, 169, 166 и 169 летучих вкусоароматических соединений соответственно. Во всех образцах самая высокая концентрация среди алкенов была у лимонена, среди ароматических соединений – у 1,1,6-триметил-1,2-дигидронафталина, среди кислородсодержащих гетероциклических соединений – у 2-ацетилфурана, среди лактонов – у дигидроактинидиолида, среди сернистых соединений – у диметилдисульфида, среди органических кислот – у 4-гидроксибутирата. В других же классах веществ были отличия: наиболее распространенными эфирами и кетонами в Да Хун Пао, Жоу Гуй и Шуйсяне были метилсалицилат и (E,E)-3,5-октадиен-2-он, а в Цзинь Фо – цис-3-гексенилгексаноат и транс-β-ионон; среди альдегидов самая высокая концентрация в Да Хун Пао была у фурфурола, а в Жоу Гуй, Шуйсяне и Цзинь Фо – у (E,E)-2,4-гептадиеналя; среди азотистых соединений и спиртов максимальный уровень в Да Хун Пао и Шуйсяне был у 1-этил-1H-пиррол-2-карбоксальдегида и (E)-неролидола, а в Жоу Гуй и Цзинь Фо – у бензилнитрила и фенилэтилового спирта.

При помощи метода частичных наименьших квадратов с дискриминантным анализом (PLS-DA) были определены 40 дифференциальных ЛВС, которые можно разделить на шесть классов (см. рис. 4).

I класс – транс-линалоолоксид (фураноид), лимонен, п-цимол и м-ксилол. Высокая концентрация в Цзинь Фо и Да Хун Пао, умеренная – в Жоу Гуй и крайне низкая – в Шуйсяне.

II класс – гексилбутират, гераниол и линалоол. Высокая концентрация в Цзинь Фо и низкая в остальных сортах.

III класс – цис-3-гексенилгексаноат, гексилгексаноат, (E)-2-гексенилгексаноат, фенетилбутират, цис-3-гексенилбензоат и гексилбензоат. Всё это сложные эфиры со свежими и фруктовыми ароматами. В Цзинь Фо и Жоу Гуй их гораздо больше, чем в Да Хун Пао и Шуйсяне.

IV класс – фенилэтиловый спирт, (E)-β-фарнезен, (E)-неролидол, фенетилацетат, бензилнитрил, фенетил-2-метилбутират, (2-нитроэтил)-бензол и индол. Высокое содержание в Жоу Гуй, но не в Цзинь Фо; самое низкое – в Шуйсяне.

V класс – метил-2-фуроат, п-метилацетофенон, метилсалицилат, 1,1,6-триметил-1,2-дигидронафталин, метилбензоат, 2-гептанон, мезитилен, 2,5-диметилпиразин, (E,E)-3,5-октадиен-2-он, N-этилпиррол, 1-этил-1H-пиррол-2-карбоксальдегид, 5-метилфурфурол, фурфурол, 1-фурфурилпиррол, бензальдегид, 2-метилпиразин и 2-ацетилфуран. Большинство из них образуются при термической обработке чая и имеют ореховые и жареные ароматы. В Да Хун Пао их концентрация была значительно выше, чем в других образцах.

VI класс – нафталин и дигидроактинидиолид. Содержание в Жоу Гуй значительно ниже, чем в остальных сортах.

Однако это не даёт понимания, какой вклад вносят эти соединения в аромат чая, поскольку пороги их обнаружения человеческим обонянием различаются на несколько порядков, и вещество, присутствующее в высокой концентрации, может быть неощутимо, а вещество, которого в сотни раз меньше, может иметь решающее значение. Для этого и нужна ольфактометрия, в ходе которой специально обученные дегустаторы, натренированные различать запахи на стандартных соединениях (например, линалоол – стандарт цветочного аромата, γ-ноналактон – сладкого и т.д.), определяли значения интенсивности аромата разных одорантов, присутствующих в Уи Янь Ча.

Всего было установлено 56 ароматически активных соединения – по 54 в Да Хун Пао, Жоу Гуй и Шуйсяне и 55 в Цзинь Фо (2-метил-3,5-диэтилпиразин был обнаружен в Да Хун Пао и Шуйсяне, кумарин – в Жоу Гуй и Цзинь Фо, 2,2,6-триметилциклогексанон – только в Цзинь Фо). 18 из них были определены как ключевые дифференциальные соединения с высокой ароматической активностью. 16 одорантов с разными типами распределения среди сортов Уи Янь Ча представлены на рис. 5.

Характерные ключевые одоранты Да Хун Пао – метилсалицилат, п-цимол, 2,5-диметилпиразин и 1-фурфурилпиррол. Два последних – продукты реакции Майяра, образующиеся при хунбэе, так что их специфичность относительна: если яньча другого сорта прогреть посильнее, они появятся в высокой концентрации и в нём.

Характерные ключевые одоранты Жоу Гуй – фенилэтиловый спирт, индол и (E)-β-фарнезен. Все они имеют цветочно-фруктовые ароматы.

Характерные ключевые одоранты Цзинь Фо – линалоол, фенэтилбутират, гексилгексаноат и дигидроактинидиолид.

Что касается Шуйсяня, то концентрации ключевых дифференциальных одорантов в нём были невысоки. Только уровень нафталина был существенно выше, чем в других сортах.

Кроме этого, концентрация N-этилпиррола и 2-ацетилфурана в Да Хун Пао и Шуйсяне была равной и значительно более высокой, чем в Жоу Гуй и Цзинь Фо, в которых, в свою очередь, было гораздо больше транс-линалоолоксида (фураноида). Это также можно использовать для различения сортов Уи Янь Ча.

***

Есть ещё ряд похожих исследований, но думаю, вы уже усвоили принцип.

Первый этап – нецелевой метаболомный анализ, то есть определение содержания не каких-то конкретных веществ, а всех, какие найдутся: летучих – с помощью газовой хроматографии, нелетучих – с помощью жидкостной.

Затем – многомерный статистический анализ, с помощью которого обнаруживаются дифференциальные метаболиты, то есть те, содержание которых статистически значимо отличается в чаях из разных культиваров, или из разных зон производства, или разного возраста и т.п.

Если нужно соотнести эти данные с непосредственными ощущениями, то проводится анализ корреляции этих данных с оценками дегустаторов и выясняется, какие метаболические показатели связаны с мягкостью вкуса, какие – с горечью, и так далее.

Поскольку дифференциальных метаболитов могут быть десятки, из них выбирают ключевые – те, которые наиболее важны для надёжного различения образцов по исследуемому параметру (ботаника, терруар, возраст etc.).

И наконец, может быть построена математическая модель, которая позволит по ограниченному числу метаболических показателей определять происхождение образцов, или их возраст, или ещё что-нибудь, и проверена её прогностическая эффективность. Обычно она составляет минимум 85-90%, а часто и выше – такая доля образцов идентифицируется верно на основании уровней всех этих линалоолов, неролидолов и 8,15-дигидроксиэйкоза-5,9,11,13-тетраеновой кислоты.

В процессе этого выявляются и регистрируются различия в химическом составе разных чаёв. Но причины их далеко не всегда ясны, потому что статистика устанавливает только связь, но не механизм этой связи.

***

И напоследок – пара работ иного рода, выполненных учёными Ключевой лаборатории промышленной биотехнологии Министерства образования КНР при факультете биотехнологии Цзяннаньского университета (г. Уси). В них исследовалась роль микроорганизмов (!) в формировании аромата и вкуса яньча.

В первой (www.sciencedirect.com/science/ar… ) установлено, что грибы оказывают выраженное влияние на содержание метаболитов в Шуйсяне, а во второй (www.sciencedirect.com/science/ar… ) – что бактерии родов Chryseobacterium, Pedobacter, Bosea, Agrobacterium, Stenotrophomonas и Actinoplanes влияют на выработку хотриенола, эпикатехингаллата и теанина в Жоу Гуй, и грибы Pestalotiopsis, Fusarium, Elsinoe, Teichospora и Tetracladium также влияют на образование нелетучих соединений.

Это невероятно интригует. Неужели действительно удалось выделить роль микрофлоры как таковой? Не может ли быть так, что особенности состава обусловлены другими факторами, действующими в месте происхождения чая, а микрофлора – просто естественная, но незначимая часть биоокружения в этой производственной зоне? Ведь не любая корреляция означает причинно-следственную связь. Классический пример – идеальное совпадение графиков продаж мороженого и числа утонувших в открытых водоёмах. И то, и другое связано просто-напросто с жарой.

Но поскольку обе публикации очень свежие – лето 2024 года – то их пока нет в свободном доступе. Ждём благородных пиратов из sci-hub`а.

Upd.: Велика, однако, сила интернета и нетворкинга! Не прошло и двух часов, как один из наших добрых чайных знакомых прислал мне полные тексты двух статей, о которых сказано в последней части поста. Спасибо ему! Но пост с их разбором я напишу, по-видимому, уже в ноябре.

Рис. 1. Вкусовые характеристики. LCSX1, LCSX2, LCSX3 – разные образцы Лао Цун Шуйсяня, SXCK – обычный Шуйсянь.