Немного о достижениях в области инструментальной оценки чая. Часть 2. Возраст

Сотрудники Ключевой лаборатории чайной биологии и использования ресурсов чая Института исследований чая Китайской академии сельскохозяйственных наук (Ханчжоу) попытались выяснить, можно ли с помощью анализа метаболома (т.е. совокупности метаболитов) белого чая определить его возраст — www.sciencedirect.com/science/ar… , sci-hub.ru/https://do… . Задача в высшей степени актуальная, ведь выдержанный белый чай высоко ценится; фудинские белые существенно дорожают при качественном хранении, из-за чего многие продавцы преувеличивают возраст чая.

Было исследовано 30 образцов Бай Хао Инь Чжэнь, Бай Муданя и Шоу Мэй от трёх фуцзяньских компаний – Пиньпиньсян, Юйжунсян и Тяньху. Возраст образцов варьировал от 1 до 17 лет, и они были разделены на четыре возрастные группы: 1 год, около 3 лет, около 7 лет и свыше 10 лет. Летучие соединения обнаруживались и идентифицировались с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии-трёхквадрупольной масс-спектрометрии (UPLC-QQQ-MS).

Было получено 2124 пика. Анализ главных компонентов (PCA) и дискриминантный анализ регрессии частичных наименьших квадратов (PLS-DA) показал, что стандарт сбора чая и продолжительность его хранения более значимы для его состава, чем производитель – см. рис. 1. Затем были идентифицированы 104 соединения, являющиеся дифференциальными для возраста чая (то есть такими, содержание которых статистически достоверно отличалось в разных возрастных группах образцов).

Если брать образцы одного стандарта сбора, но разного возраста, то уровень большинства этих веществ – катехинов, флавоноловых и флавоновых гликозидов, аминокислот и др. – снижался с течением времени. Лишь 17 соединений показали тенденцию к росту: галловая кислота, аденозин, (S)-5′-дезокси-5′-метилсульфиниладенозин, глицерофосфохолин, теобромин, пироглутаминовая кислота, азелаиновая кислота, 2-[4-(3-гидроксипропил)-2-метоксифенокси]-1,3-пропандиол, мирицетин-3-арабинозид, N,N’-дициклогексилмочевина и семь различных C-8 N-этил-2-пирролидон-замещённых флаван-3-олов (EPSFs), в этой работе они обозначены как R-EGCG-cThea, S-EGCG-cThea, R-ECG-cThea, R-EGC-cThea, S-EGC-cThea, R-EC-cThea и S-EC-cThea. EPSFs – это такие сугубо чайные вещества, образующиеся из катехинов и теанина, подробнее об этом мы писали здесь — vk.com/wall-47905050_23296 . Больше всего оказалось R-EGCG-cThea, что неудивительно: его предшественник эпигалокатехингаллат – главный из катехинов чая. EPSFs продемонстрировали самую сильную положительную корреляцию со сроками хранения чая: в Бай Хао Инь Чжэнь она составляла от 0,913 до 0,998, в Бай Муданях – от 0,502 до 0,995, в Шоу Мэй – от 0,696 до 0,998. Проще говоря, чем старше белый чай, тем больше в нём образуется этих самых C-8 N-этил-2-пирролидон-замещённых флаван-3-олов – см. рис. 2. Кроме того, сильная положительная корреляция с возрастом чая была выявлена у пироглутаминовой кислоты, образующейся при циклизации глутаминовой кислоты или глутамина.

Потом 27 соединений были отобраны в качестве ключевых – влияние возраста на их содержание было наибольшим – и использованы для построения прогностической модели. Всё по схеме, уже знакомой вам по первой части статьи: регрессия до как можно меньшего числа наиболее значимых показателей ( это оказались содержание R-EC-cThea, содержание R-EGCG-cThea, содержание теогаллина, отношение S-EC-cThea к эпикатехину и отношение общих EPSFs к теанину), обучающий набор, тестовый набор… Итоговая формула выглядит следующим образом: расчётный возраст белого чая в годах = 76,224 × [содержание R-EC-cThea (мг/г)] + 10,520 × [содержание R-EGCG-cThea (мг/ г)] + 14,838 × [содержание теогаллина (мг/г)] — 35,844 × [отношение S-EC-cThea/EC] + 51,439 × [отношение EPSFs/теанин] — 1,068. Коэффициент линейной корреляции был равен 0,9294 для обучающего набора и 0,8812 для тестового. Погрешности при определении возраста составили от -4,29 до 1,78 лет в обучающем наборе (в среднем 1,14 года) и от -6,37 до 1,84 лет в тестовом (в среднем 1,62 года). И они были бы ещё меньше, если исключить два самых старых образца, 12-летний и 17-летний, где ошибка оказалась максимальной – очевидно, после десяти лет хранения наработка EPSFs снижается, и рост их содержания перестаёт быть линейным.

Итак, измерив содержание перечисленных веществ, можно определить возраст белого чая с точностью до 1-1,5 лет. Если он не больше 10 лет.

Но есть одна проблема. Как и говорилось в посте о пуэринах, это будет работать только с чаем с неискажённой технологией, хранившемся в сухих условиях. Если же взять чай, искусственно состаренный путём хранения при повышенной влажности и температуре, или чай, сделанный с удлинённым завяливанием и т.п., модель неизбежно будет давать сбои.

Тем не менее, эти две работы ханчжоуских учёных наглядно демонстрируют принцип: на первом этапе изучаются различия в составе свежих и выдержанных чаёв, на втором этапе на этой основе разрабатывается методика вычисления предполагаемого возраста.

***

А вот учёные факультета пищевых наук Юго-западного университета (Чунцин) пошли другим, очень впечатляющим путём – см. pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… .

Для пуэра возраст ещё более важен, чем для белого чая, и при его определении желательна как можно бóльшая точность. Но изменения химического состава пуэра сильно зависят от условий его хранения, и графики, например, перехода катехинов в их производные не будут универсальными, их придётся строить чуть ли не для каждого склада отдельно… Однако есть показатели, которые не меняются с течением времени и могут послужить своего рода «отпечатками пальцев», однозначно указывающими на год, в котором был собран чай. Это – изотопные соотношения. Соотношения разных изотопов углерода, водорода, кислорода и т.д. различаются от региона к региону, а также в одном регионе в разные года. Но в готовом чае они уже не изменятся.

Образцы пуэра 2014, 2015, 2016, 2017 и 2018 гг. (по 9 образцов для каждого года) от одного и того же производителя из уезда Фэнцин были подвергнуты масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) и масс-спектрометрии с анализатором изотопных отношений элементов (EA-IRMS). Для каждого из образцов были определены 39 соотношений стабильных изотопов минеральных элементов (109Ag/107Ag, 138Ba/137Ba, 81Br/79Br, 112Cd/111Cd, 114 Cd/112Cd, 114Cd/111Cd, 53Cr/52Cr, 72Ge/70Ge, 74Ge/72 Ge, 74Ge/70Ge, 202Hg/200Hg, 7Li/6Li, 96Mo/95Mo, 98 Mo/96Mo, 98Mo/95Mo, 60Ni/58Ni, 207Pb/206Pb, 208Pb/207 Pb, 208Pb/206Pb, 123Sb/121Sb, 80Se/78Se, 120Sn/118Sn, 88Sr/86Sr, 47Ti/46Ti, 48Ti/47Ti, 48Ti/46Ti, 205Tl/203Tl, 66Zn/64Zn, 68Zn/66Zn, 68Zn/64Zn, 153Eu/151Eu, 154Sm/152Sm, 158Gd/156Gd, 160Gd/158Gd, 160Gd/156Gd, 164Dy/162Dy, 168Er/166Er, 174Yb/172Yb,176Lu/175Lu), а также δ13C, δ15N, δD и δ18O. Полученные данные были обработаны сразу пятью статистическими методами – анализ главных компонентов (PCA), иерархический кластерный анализ (HCA), дискриминантный анализ регрессии частичных наименьших квадратов (PLS-DA), искусственная нейронная сеть с обратным распространением (BP-ANN) и линейный дискриминантный анализ (LDA), что позволило сравнить их эффективность.

Объём данных очень велик, поэтому изложу самое главное вкратце.

Даже одной только δ18O (величины отклонения соотношения кислорода-18 и кислорода-16 от VSMOW – Венского стандарта средней океанической воды) оказалось достаточно для возрастной аутентификации пуэра, а с помощью δ13C, δ15N и δD это можно сделать ещё надёжнее – см. рис. 3. Из 39 соотношений изотопов минеральных элементов статистически значимыми оказались 14: 138Ba/137Ba, 114Cd/111Cd, 72Ge/70Ge, 74Ge/70Ge, 53Cr/52Cr, 98Mo/96Mo, 96Mo/95Mo, 98Mo/95Mo, 208Pb/207Pb, 48Ti/47Ti, 154Sm/152Sm, 158Gd/156Gd, 160Gd/156Gd и 174Yb/172Yb. Три показателя – δD, δ13C и 154Sm/152Sm имели максимальную прогностическую ценность.

Методы BP-ANN и LDA (см. рис. 4) продемонстрировали стопроцентную (!) точность: верно идентифицированы были все образцы и в обучающем, и в тестовом наборе.

Разве это не круто? Достаточно собрать соответствующую базу данных – и можно будет с абсолютной точностью определить год изготовления чая, а в перспективе – и место его происхождения. У меня есть знакомый, который мечтал об этом – и вот его мечта буквально в шаге от воплощения в реальность.

***

И ещё одна похожая публикация, совсем свежая – 2024 года, об Уи Шуйсяне – см. pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/P… .

Факультет чая и пищевых наук Университета Уи (Уишань), пять образцов Шуйсяня от одного и того же производителя, 2020, 2018, 2014, 2010 и 2006 гг., ультравысокоэффективная жидкостная хроматография с квадрупольно-времяпролётной масс-спектрометрией (UPLC‐Q‐TOF‐MS), анализ главных компонентов (PCA), анализ регрессии частичных наименьших квадратов (PLSR).

Было идентифицировано 1201 соединение. Вплоть до 2010 года абсолютное содержание основных классов веществ оставалось сравнительно стабильным, сохранялось и соотношение между ними – см. рис. 5. А затем наступил резкий перелом, и содержание почти всех классов соединений снизилось, но неравномерно: содержание аминокислот упало вдвое, и благодаря этому относительное содержание спиртов, аминов, нуклеотидов и их метаболитов, флавоноидов, гетероциклических соединений, органических кислот и их производных несколько выросло.

Интересно, что среди дифференциальных соединений в парах образцов разных лет оказалось множество низкомолекулярных пептидов. Едва ли они вносят какой-то вклад во вкус чая, но они могут оказаться перспективным маркером возраста. Неожиданно.

Было установлено 29 соединений, достоверно коррелирующих со временем хранения: пять – положительно (то есть их содержание растёт), это формиат альфа-терпинеола, карнозол, 2-фенилэтил-D-глюкопиранозид, эллаговая кислота и D-рибозилникотиновая кислота, а двадцать четыре – этиллинолеат, лейкоцианидин, цис-3-гексенилацетат, 2-фенилэтанол, проантоцианидин C1, эпигаллокатехингаллат, теафлавин-3,3′-бис-галлат и др. – отрицательно, их содержание при хранении падает.

Анализ регрессии частичных наименьших квадратов позволил чётко разделить образцы разных лет – см. рис. 6.

Как видите, набор ключевых соединений совершенно иной, но современные методы обработки данных и в случае Уи Шуйсяня дают хороший результат. Правда, практическая ценность уишаньской работы лично для меня под вопросом: насколько можно понять, образцы не проходили сессии повторного прогрева, а это нетипично для лаояньча. И хунбэй наверняка изменил бы картину.

Кроме того, в статье так настойчиво подчёркивается, что существенные изменения в составе Уи Шуйсяня происходят только после десяти лет хранения, что невольно возникает впечатление, что эта публикация рассчитана на использование в качестве элемента пропаганды употребления выдержанного чая. А такая пропаганда в Китае непрерывно усиливается – к этому вынуждает хронический кризис перепроизводства в чайной индустрии… Но это отдельная тема.

Главное, что определение возраста чая стремительно превращается в рутинную техническую (и отчасти математическую) задачу.

Рис. 1. Разделение образцов белого чая с помощью дискриминантного анализа регрессии частичных наименьших квадратов (PLS-DA).
А – по стандарту сбора (BHYZ – Бай Хао Инь Чжэнь, BMD – Бай Мудань, SM – Шоу Мэй),
B – по производителям,
C – по возрасту.

Рис. 2. Рост содержания C-8 N-этил-2-пирролидон-замещённых флаван-3-олов (EPSFs) в белом чае с течением времени.
А – Бай Хао Инь Чжэнь,
B – Бай Мудань,
C – Шоу Мэй.

Рис. 3. Диаграммы показателей стабильных изотопов углерода, азота, водорода и кислорода в пуэре пяти разных лет производства.
А – δ13C,
B – δ15N,
C – δD,
D – δ18O.