Опять о формировании аромата улунов

Летучие соединения чайных листьев, ответственные за аромат и, косвенным образом, за вкус чая, можно разделить на четыре основных группы: терпеноиды, фенилпропаноиды/бензоиды, производные жирных кислот и каротиноиды.

Монотерпеноиды синтезируются из ацетил-коэнзима А и пирувата, образующихся при катаболизме углеводов. К ним относятся, например, линалоол (свежий цветочный запах), линалоолоксиды (цветочный) и гераниол (цветочный, похожий на запах розы).

Большинство летучих фенилпропаноидов и бензоидов образуются из фенилаланина – в частности, 2-фенилэтанол (цветочный, розовый), бензиловый спирт (слабый цветочный запах) и фенилацетальдегид (цветочный, розовый).

Производными жирных кислот являются спирты с прямой углеродной цепью, альдегиды, кетоны, эфиры и лактоны. Они образуются, в основном, в результате α-окисления, β-окисления и реакций липоксигеназного пути. Примеры – гексанол (тон зелени), (Z)-3-гексен-1-ол (запах зелени и листьев) и метилжасмонат (цветочный, похожий на жасмин).

Наконец, окислительное расщепление каротиноидов приводит к образованию иононов и дамасконов.

Чуть подробнее об этом мы писали здесь — vk.com/wall-47905050_22974 .

Летучие вкусоароматические вещества содержатся в листьях чайных растений не только в свободном виде, но и в форме гликозидов, в которых они связаны с углеводными остатками. Гликозиды обычно менее летучи, менее реакционноспособны и лучше растворимы в воде, чем свободные вкусоароматические вещества. Из чайных листьев было выделено и идентифицировано много различных β-примеверозидов (углеводный остаток – β-примевероза) и β-глюкопиранозидов (соответственно, β-глюкопираноза), агликонами которых являются чаще всего спирты и фенолы – бензиловый спирт, 2-фенилэтанол, 1-фенилэтанол, метилсалициловый эфир, (Z)-3-гексенол, линалоол, линалоолоксиды и гераниол, а также ряд других веществ, не являющихся спиртами – бензальдегид, кумарин и дамасценон.

Есть множество примеров того, как биотический (например, атака насекомых-вредителей) и абиотический стресс (например, затенение) приводит к повышению содержания летучих вкусоароматических соединений в чайных листьях. Растёт оно и во время обработки чайного сырья. Улуны и красные чаи содержат больше разнообразных ЛВС, чем зелёный чай, и долгое время считалось, что это связано с гидролизом их гликозидно-связанных форм в процессе производства: эти вкусоароматические прекурсоры содержатся в вакуолях, а расщепляющие их ферменты – гликозидазы – соединены с клеточной стенкой; при повреждении листьев субстрат и фермент встречаются.

Однако было обнаружено, что если при производстве красного чая активность гликозидаз достигает максимума к концу завяливания, и содержание гликозидов уменьшается во время ферментации, то при производстве улунов этого не происходит. Содержание большинства гликозидно-связанных форм ЛВС увеличивается во время завяливания и не снижается, а ещё больше нарастает во время выделки зелени.

Группа учёных из Ключевой лаборатории молекулярного анализа и генетического улучшения южно-китайских сельскохозяйственных растений Китайской академии наук (Гуанчжоу) изучила это явление более обстоятельно – см. www.researchgate.net/publicatio… . Полный текст публикации прикреплён к посту в формате pdf, а ниже я перескажу самое основное.

***

Флеши до второго-третьего листа культивара Цзинь Сюань были собраны на опытных участках Чайной экспериментальной станции Южно-китайского сельскохозяйственного университета и обработаны обычным методом: завяливание на солнце при 43°С в течение 70 минут (SW), завяливание в помещении при 27°С и 70% относительной влажности в течение 2 ч (IW), пять протряхиваний с интервалами 1,5 ч (T1-T5), фиксация во вращающемся металлическом барабане при 250°С в течение 2-3 минут (F), 15-минутное сминание и скручивание, 1,5-часовая сушка при 105°С. На каждой из стадий от сбора листьев (P) до фиксации (F) отбирались образцы для измерения содержания ЛВС.

Кроме этого, измеряли ферментативную активность β-глюкозидазы и β-примеверозидазы, экспрессию генов β-примеверозидазы, 9/13-липоксигеназы и терпенсинтаз, а также наблюдали за структурой клеток чайных листьев на разных стадиях обработки.

***

Содержание многих ЛВС значительно увеличилось во время выделки зелени. Прежде всего это индол, жасмонолактон (в оригинале — jasmine lactone; в одних базах данных жасминовый лактон и жасмонолактон рассматриваются как синонимы, в других – как разные вещества; я буду считать, что речь о C10H16O2 – см. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/J… ) и транс-неролидол, а также ряд производных жирных кислот – 1-гексанол, (E)-2-гексен-1-ол, (Z)-3-гексен-1-ол и др., линалоолоксиды и α-фарнезен. Другие же – линалоол, гераниол, диендиол I, бензиловый спирт, 2-фенилэтанол и метилсалицилат – существенно не изменялись (см. рис. 1).

Авторы рассматривают индол, жасмонолактон и транс-неролидол как наиболее характерные для улунов ЛВС – в красных чаях их содержание гораздо ниже. В рамках этой работы они отбирали часть сырья после первого встряхивания, растирали его до кашицеобразного состояния, выдерживали 4,5 ч (cell disruption-1) и 6 ч (cell disruption-2) и сравнивали с флешами после четвёртого (СК-1) и пятого (СК-2) встряхивания. Содержание индола, жасмонолактона и транс-неролидола в растёртых листьях резко падало (см. рис. 2) – очевидно, как за счёт нарушения их синтеза, так и за счёт их окисления. Я бы сказал, правда, что такое жёсткое механическое воздействие – слишком грубая модель сминания и скручивания при производстве красных чаёв…

Содержание гликозидно-связанных ЛВС в растёртых листьях также снижалось (см. последнюю диаграмму рис. 2), а во время выделки зелени при производстве улуна – оставалось неизменным или даже росло (см. рис. 3). Авторы предполагают, что причина в том, что клеточные стенки при протряхивании не разрушаются, и гликозидазы не контактируют со своими субстратами. Подтвердить локализацию именно чайных гликозидаз им не удалось, но они наглядно продемонстрировали, что в листьях табака β-примеверозидаза с флуоресцентной меткой действительно связана с клеточными стенками и отсутствует в протопластах, где идёт синтез гликозидов (см. рис. 4). А вот то, что клеточные стенки чайных листьев сохранны даже после пяти протряхиваний, когда клетки сжаты и деформированы, а внутриклеточные структуры повреждены, прекрасно видно на электронных микрофотографиях (см. рис. 5).

При выделке зелени не повышалась ни активность β-глюкозидазы и β-примеверозидазы, ни экспрессия гена β-примеверозидазы. Зато увеличивалась экспрессия генов 9/13-липоксигеназы (LOX) и терпенсинтаз (TPS1-TPS3) – см. рис. 6. Этим и объясняется наработка жасмонолактона (он является продуктом окисления жирных кислот под действием липоксигеназы) и транс-неролидола (он относится к терпеноидам, которые синтезируются терпенсинтазами).

***

Давайте подытожим.

Считать, что суть обработки чайного листа при производстве улунов в «частичной ферментации», отличающейся от «полной ферментации» красных чаёв только степенью – колоссальное заблуждение. И очень жаль, что в «чайных школах» новичкам до сих пор рассказывают эту ерунду, а продавцы всё ещё используют такие понятия, как «степень ферментации» улунов, «сильноферментированные» и «слабоферментированные» улуны, которые полностью лишены смысла! Стыд и позор.

При сминании и скручивании в процессе производства красного чая разрушаются клеточные стенки, и гликозидазы встречаются со своими субстратами – гликозидами. И во время ферментации идёт гидролиз гликозидов с высвобождением ЛВС. В то же время, часть ЛВС окисляется. Разумеется, параллельно происходит окисление и конденсация полифенолов – но на формирование аромата это оказывает минимальное влияние.

При выделке зелени в процессе производства улунов клеточные стенки не разрушаются, и гидролиз гликозидов не запускается. Зато в качестве реакции на стресс повышается экспрессия генов ряда ферментов, участвующих в синтезе других ЛВС, их синтез значительно усиливается, и возникает совершенно другая ароматическая палитра.

Это принципиально разные процессы. Схематически эта разница изображена на рисунке 7.

***

Вот ещё одна работа на ту же тему — www.researchgate.net/publicatio… . Рисунок 8 взят из неё. Видно, что при производстве красного чая сразу же после сминания и скручивания содержание β-примеверозидов резко падает (интересно, что содержание β-глюкопиранозидов практически не изменяется при ферментации) – а при производстве улунов к концу выделки зелени содержание всех гликозидов увеличивается.

Как видите, эти процессы в улунах и в красных чаях полностью противоположны.

***

Какой вопрос должен возникнуть у внимательного и вдумчивого читателя?

Внимательный и вдумчивый читатель должен сказать: стоп! Что-то не сходится.

В живом чайном листе гликозиды и гликозидазы находятся в разных местах и не встречаются друг с другом. У красных чаёв они встречаются после сминания, когда разрушаются клеточные стенки. А протряхивания улунов для этого недостаточно. Допустим.

Но ведь и полифенолы в живом чайном листе не встречаются с полифенолоксидазами. Они для того и нужны, чтобы встретиться друг с другом при его повреждении. Это два компонента бинарного оружия, которое включается при атаке вредителей. Продукты окисления катехинов обладают сильными дубящими свойствами, и это сильно мешает спокойно кушать чайные листья.

И для запуска этой реакции протряхивания вполне достаточно! У улунов в классическом стиле на краях листьев заметна красноватая кайма – это и есть травмированные участки, где катехины превратились в теафлавины и теарубигины.

Если гидролиз гликозидов не запускается, то почему запускается окисление полифенолов?

Потому, что полифенолоксидаза у большинства растений находится не в клеточной стенке, а в пластидах – хлоропластах и лейкопластах (см. www.mdpi.com/1420-3049/… ). Мембраны пластид при выделке зелени, очевидно, разрушаются.

Бывают, кстати, и исключения: полифенолоксидаза львиного зева – ауреузидинсинтаза – находится прямо в вакуолях, там же, где её субстрат (см. pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16367960/ ). Но она там не сидит в засаде, поджидая вредных букашек, а работает: производит краску для цветков.

***

А над чем ещё должен задуматься толковый читатель?

Толковый читатель должен подумать: опять что-то не сходится!

Завяливая белый чай из нежного сырья, механического повреждения избегают. А гидролиз гликозидов при этом, говорят, идёт вовсю! Как же это?

Действительно, содержание большинства β-примеверозидов и β-глюкопиранозидов во время завяливания снижается – см. рис. 9, взятый из статьи sci-hub.ru/10.1016/j…. . Хорошо видно, что распад гликозидов становится существенным к концу первых суток и на вторые сутки вэйдяо. В этой же работе сотрудники Ключевой лаборатории биологии и использования ресурсов чая Научно-исследовательского института чая г. Ханчжоу установили, что экспрессия генов β-глюкозидазы к концу первых суток значительно увеличивается. К сожалению, вопросы целостности клеточной стенки в ней не рассматриваются. Можно выдвинуть осторожное предположение, что длительное, двухдневное завяливание приводит к её повреждению – не за счёт механического воздействия, а за счёт гидролитического распада её полимеров. А пластиды остаются целыми – и бурного окисления полифенолов не происходит. Но это лишь домыслы, эти механизмы ещё предстоит изучить.

Поторопившись с выводами, можно решить, что хотя фактором, запускающим биохимические процессы во время обработки белого чая, является, как и у улунов, стресс, реагирует белый чай на него «по-красному» — гидролизом гликозидов. Но это лишь одна сторона дела. На вторые сутки завяливания увеличивается экспрессия генов липоксигеназ (в точности как при выделке зелени у улунов), фенилацетальдегидредуктазы, фарнезилдифосфатсинтазы и других ферментов, участвующих в синтезе ЛВС; изменяется соотношение субъединиц триптофансинтазы, хотя и несколько иначе, чем у улунов (см. pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27263428/ ).

Вот поэтому для создания настоящего белого чая необходимо длительное завяливание. Если просто собрать чайные листья и высушить, то эти процессы не успеют запуститься, аромат и вкус не сформируются, и получится безвкусный чайный гербарий, а не белый чай.

Does Enzymatic Hydrolysis of Glycosidically Bound Volatile Compounds Really Contribute to the Formation of Volatile Compounds…pdf

Рис. 1. Изменение содержания летучих вкусоароматических соединений в процессе производства улуна.

P – свежесобранные чайные листья,
SW – после завяливания на солнце,
IW – после завяливания в помещении,
T1-T5 – после 1-5 встряхиваний,
F – после фиксации.

Рис. 2. Снижение содержания индола, жасмонолактона, транс-неролидола и гликозидно-связанных ЛВС в растёртых листьях по сравнению с целыми листьями, прошедшими выделку зелени.

СК-1 – чайные листья после четырёх встряхиваний,
cell disruption-1 – чайные листья, растёртые после первого встряхивания, после выдержки в течение 4,5 ч,
СК-2 – чайные листья после пяти встряхиваний,
cell disruption-2 – чайные листья, растёртые после первого встряхивания, после выдержки в течение 6 ч.

Рис. 3. Изменение содержания гликозидно-связанных форм летучих вкусоароматических соединений в процессе производства улуна.

Рис. 4. Субклеточная локализация β-примеверозидазы в листьях табака (зелёное свечение). Видна ассоциация фермента с клеточной стенкой и отсутствие его в хлоропластах и цитоплазме.

Рис. 5. Электронная микрофотография чайного листа в процессе производства улуна. Видна постепенная деградация внутриклеточных структур – и сохранение целостности клеточной стенки.

P – свежесобранные чайные листья,
T1, Т2 и T5 – после 1, 2 и 5 встряхиваний.

Рис. 6. Изменение активности некоторых ферментов и экспрессии их генов в процессе производства улуна.

Рис. 7. Схема различий в процессах формирования аромата улунов и красных чаёв.

Рис. 8. Изменение содержания гликозидно-связанных форм летучих вкусоароматических соединений при производстве красного чая (слева) и улуна (справа). Верхние диаграммы – β-примеверозиды, нижние – β-глюкопиранозиды.