Снова о механизмах формирования аромата улунов. Линалоол, неролидол, индол

Многие летучие вкусоароматические соединения (ЛВС) чая по своему химическому строению являются терпеноидами. Их природная роль – отпугивать вредителей чайных растений; некоторые из них являются также сигнальными веществами, адресованными другим чайным кустам и другим членам экосистемы. Биосинтез терпеноидов, от которых напрямую зависит аромат и вкус чая, регулируется весьма тонко, некоторые механизмы этой регуляции довольно замысловаты. И вот вам пример.

Лю Гофэн и другие научные сотрудники Государственной ключевой лаборатории биологии и использования чайных растений Аньхойского сельскохозяйственного университета в 2017 г. изучили сплайсинг транскриптов гена терпенсинтазы CsLIS/NES (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.13080 ). Не очень-то понятно, да? Сейчас попробую объяснить, максимально всё упростив.

Ген – это часть молекулы ДНК, в которой зашифрована последовательность аминокислот какого-нибудь белка. Чтобы синтезировать этот белок, информация с ДНК переносится на матричную РНК (которая затем служит программой для рибосом, занимающихся сборкой белков), этот процесс называется транскрипцией. Но РНК – не просто копия ДНК. В ДНК есть участки, кодирующие белок – экзоны, и не кодирующие – интроны, они чередуются друг с другом. Интроны нужно вырезать, а экзоны – сшить вместе, и это вырезание и сшивание называется сплайсингом, а вся обработка первичного транскрипта, в результате которой он превращается в зрелую мРНК – процессингом. И оказывается, из некоторых генов образуются разные версии мРНК – их по-разному «кроят», не только удаляя интроны, но и экзоны задевая – и они кодируют немного отличающиеся белки. Удобно: ген один, а белков получается несколько. Это – так называемый альтернативный сплайсинг.

Так вот, в листьях и цветах чайных растений есть ген CsLIS/NES, кодирующий фермент, который синтезирует и линалоол (его запах ближе всего к запаху ландыша), и (E)-неролидол (имеющий специфический цветочный, но отчасти и древесный аромат), поэтому и название через косую черту: линалоолсинтаза/неролидолсинтаза (а Cs значит Camellia sinensis). А всё потому, что у этого гена два разных транскрипта: подлиннее – CsLIS/NES-1 и покороче – CsLIS/NES-2. Причём in vitro – «в пробирке» — оба белка ведут себя сходным образом: то, что они насинтезируют, зависит от субстрата. Если дать им геранилдифосфат, получится больше 70% линалоола, а остальное – смесь β-мирцена, (Z)-β-оцимена и (E)-β-оцимена. А если дать фарнезилдифосфат, на выходе будет чистый (E)-неролидол.

Но in planta – в живом растении – эти ферменты действуют по-разному. В составе CsLIS/NES-1 есть транзитный пептид, помогающий этой версии белка попасть внутрь хлоропластов, а CsLIS/NES-2 остаётся снаружи, в цитозоле. Биосинтез монотерпенов (с десятью атомами углерода), к которым относится линалоол, и дитерпенов (с двадцатью) происходит в хлоропластах, где много геранилдифосфата, а биосинтез сесквитерпенов (с пятнадцатью атомами углерода), к которым относится неролидол, — в цитозоле и пероксисомах, где много фарнезилдифосфата. Вот поэтому CsLIS/NES-1 в тканях чая отвечает за линалоол, а CsLIS/NES-2 – за неролидол. CsLIS/NES-1 больше в молодых побегах, а CsLIS/NES-2 (и, соответственно, неролидола) – в цветах.

Интересно, что при обработке листьев метилжасмонатом, выполняющим у растений роль медиатора стресса (о жасмоновой кислоте и её производных мы писали здесь — https://vk.com/wall-47905050_18586 ), экспрессия CsLIS/NES-1 увеличивалась почти в 6 раз, а экспрессия CsLIS/NES-2 существенно не изменялась. То есть при некоторых видах стресса растёт продукция не просто этой терпенсинтазы, а именно её хлоропластового, «линалоолового» варианта. Аромат не просто усиливается, а качественно меняется – в цветочную сторону. И происходит это за счёт регуляции сплайсинга, сдвига обычного соотношения между CsLIS/NES-1 и CsLIS/NES-2. Но каков механизм такой регуляции, учёным ещё предстоит выяснить.

Работа очень любопытная, в ней много деталей, которые заставляют гордиться прогрессом в области генетики и эпигенетики. Например, Лю Гофэн и соавторы, выделив ген CsLIS/NES, создавали на его основе кодирующие последовательности CsLIS/NES-1 и CsLIS/NES-2, вводили их с помощью вируса табачной мозаики в бактерию Agrobacterium tumefaciens, а с помощью этой бактерии – в листья табака (об агробактериальной генетической трансформации мы писали здесь — https://vk.com/wall-47905050_21331 ). Смысл был в том, чтобы создать растения, в которых есть только CsLIS/NES-1, и растения, в которых есть только CsLIS/NES-2, и сравнить их (у табака гена CsLIS/NES, как вы понимаете, нет). Но это совсем уже не о чае.

***

По данным, которые опубликовали в 2017 г. Чжоу Ин, Цзэн Ланьтин и другие учёные из Ключевой лаборатории молекулярного анализа и генетического усовершенствования сельскохозяйственных растений Южного Китая и Ключевой лаборатория прикладной ботаники провинции Гуандун, и экспрессия CsNES и уровень (E)-неролидола повышается при выделке зелени в процессе производства улунов (см. https://sci-hub.ru/10.1016/j.foodchem.2017.03.122 ).

В этой работе самое интересное – синергический эффект двух стрессовых факторов: механического повреждения и холода. Само по себе охлаждение чайных листьев синтез неролидола не стимулирует. Но если после встряхивания выдерживать листья при пониженной температуре, то неролидола нарабатывается значительно больше, чем в тепле. Оптимум при этом – 15°С. При 5, 10 и 20°С уровень неролидола ниже.

Эмпирически это было установлено чайными технологами несколько столетий назад. Без секвенаторов, газовых хроматографов и масс-спектрометров, пользуясь лишь хорошо натренированными глазами, носами и языками, они выяснили, что наиболее ароматным чай становится при чередовании встряхивания и выдерживания в прохладном помещении. А во второй половине апреля и начале мая в Уишане по ночам как раз около 15 градусов. Вот как мудро устроена природа!

***

В том же 2017 г. Мэй Синь, Чжоу Ин, Цзэн Ланьтин и соавторы изучили механизмы влияния укусов маленьких зелёных цикадок на содержание линалоола в чайном сырье (см. https://sci-hub.ru/10.1016/j.foodchem.2017.05.124 ). Уровень линалоола при воздействии вредителей, разумеется, растёт.

Здесь отмечу три момента.

Во-первых, главный фактор, приводящий к повышению экспрессии линалоолсинтаз и выработки линалоола – неглубокое, многократно повторяющееся в течение длительного времени механическое повреждение. Когда учёные смастерили прибор, непрерывно колющий чайные листья, то биохимический результат его работы оказался очень близким к укусам насекомых. Так что дело не в «слюнях цикадок» или что там ещё можно прочитать в рунете.

Отсюда и необходимость продолжительного, но деликатного встряхивания при выделке зелени улунов – однократная травма ничего не даст, нужно продолжительное травмирование.

Во-вторых, линалоол оптически активен, у него два стереоизомера – (R)-(-)-линалоол (ликареол) и (S)-(+)-линалоол (кориандрол). Аромат у них различается: ликареол более древесный и лавандовый, а кориандрол – сладко-цветочный с оттенком петигрейна. Разные линалоолсинтазы дают разные стереоизомеры линалоола. У резуховидки Таля, например, есть оба изомера. Но чайные линалоолсинтазы синтезируют только (S)-(+)-линалоол.

В-третьих, Empoasca (Matsumurasca) onukii Matsuda, Empoasca vitis (Goëthe) и Jacobiasca formosana (Paoli) – одно и то же насекомое. «Он же Гоша, он же Гора, он же Жора…»

***

Индол – ещё одно ЛВС, вносящее вклад в аромат улунов. Это гетероциклическое соединение – предшественник многих биологически активных веществ, в частности, ауксинов – фитогормонов, стимулирующих и регулирующих рост побегов и плодов, и бензоксазиноидов – защитных экзометаболитов корней растений. В чистом виде индол имеет неприятный запах прелой капусты, но в разбавленных растворах приобретает цветочный аромат; он входит в состав эфирных масел жасмина и цитрусовых; считается, что он важен для привлечения насекомых-опылителей. Выработка индола в чайных листьях усиливается при атаках вредителей; как стрессовый медиатор, он мобилизует защитные механизмы и атакованного куста, и соседних.

Уже знакомый нам коллектив Ключевой лаборатории молекулярного анализа и генетического усовершенствования сельскохозяйственных растений Южного Китая при поддержке ряда других научных учреждений, преимущественно гуанчжоуских, в 2016 г. попытался разобраться, почему индол, образование которого стимулируется повреждением чайных листьев, активно вырабатывается при протряхивании чайных листьев в процессе производства улунов, но в красных чаях его содержание невелико (см. https://sci-hub.ru/https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6.. ).

Индол – промежуточный метаболит при синтезе триптофана, катализируемом триптофансинтазой. Триптофансинтаза – не просто фермент, а целый маленький конвейер, состоящий из четырёх субъединиц – двух α и двух β. Альфа-субъединицы гидролизуют индол-3-глицеролфосфат с образованием глицеральдегид-3-фосфата и индола, а бета-субъединицы берут этот индол, берут серин, соединяют друг с другом – и получается аминокислота триптофан. Так умеют делать бактерии, растения, грибы – короче, все, кроме животных. А животные разучились и должны получать триптофан с пищей.

У чайных растений есть три версии гена, кодирующих бета-субъединицу триптофансинтазы – и, соответственно, три немного различающиеся версии этой субъединицы: CsTSB1, CsTSB2 и CsTSB3. Со своей прямой задачей – конденсацией индола и серина – все они справляются примерно одинаково. Но CsTSB2 – единственная из трёх – вдобавок активирует CsTSА, альфа-субъединицу. Без этого CsTSА ленится и не желает обеспечивать бета-субъединицы индолом.

И оказывается, что если на чайный лист никто не посягает, то количество и функциональная активность всех версий субъединиц сбалансированы так, чтобы образующийся индол почти полностью перерабатывался в триптофан. Но если чайный лист атакуют вредители, резко возрастает экспрессия CsTSB2 – и только её. Выработка индола настолько увеличивается, что он не успевает превращаться в триптофан. Мирный заводик по производству важной аминокислоты превращается в дивизион войск химической защиты. А всего-то и нужно – подрегулировать объёмы транскрипции одной из версий гена!

И то же самое происходит при неглубоком, но продолжительном механическом повреждении сорванных чайных листьев, чередующемся с паузами для того, чтобы вышеописанные процессы успели развернуться – то есть при выделке зелени улунов.

А вот при сильном сминании и скручивании чайного листа с разрушением его клеточных стенок и повреждением мембран работа триптофансинтазы полностью останавливается. Поэтому в классических красных чаях индола мало.

Но если мы успеем наработать индол до сминания, то весь он сохранится – ведь и превратить его в триптофан тоже будет некому. И добавив «улунское» протряхивание перед ферментацией красных чаёв, мы сделаем их более ароматными – так делают многие Чаочжоу Хун Ча, тайдунские Хун Улуны и т.п.

***

В очередной раз призываю обратить внимание: обработка улунов – не то же самое, что окисление красных чаёв, только слабее и по краям; не «частичная ферментация», прекратите, пожалуйста, повторять эту глупость! Это принципиально иной процесс с совершенно другой биохимической подоплёкой.

Транскрипты CsLIS/NES. Чёрные жирные полосы – экзоны, тонкие изогнутые линии между ними – интроны.