Немного о дупликации генов и её роли в формировании метаболических путей чайных растений

Главная особенность состава почек и листьев чайных растений – высокое содержание катехинов, особенно галлированных, кофеина и L-теанина, специфической чайной аминокислоты. Полифенолы флавоноидного ряда широко распространены в растительном мире (правда, их наборы сильно различаются), кофеин встречается реже (и растения, способных его продуцировать в существенном количестве, прекрасно вам знакомы – кофе, какао, кола, гуарана, падуб парагвайский), L-теанин – ещё реже, но всё-таки не только в чае. Но всё это вместе – это бесспорно уникальное явление.

Биосинтез каждого из этих веществ проходит в несколько этапов, и за каждый этап отвечает свой фермент, контролируемый определёнными генами. Выстраивание этих метаболических путей заняло миллионы лет, и современные методы исследования дают возможность узнать, как именно это происходило.

Задумывались ли вы когда-нибудь, как образуются новые гены? Вот не было до какого-то момента в той или иной эволюционной линии белка с определённой функцией, а потом он появился. Как минимум, нужен ген, кодирующий этот белок, а ещё может потребоваться регулирование активности этого белка, а для этого тоже будут нужны либо новые гены, либо изменения в старых. Как это происходит, если значимая мутация в генетическом материале с большой вероятностью будет выбракована естественным отбором? Да и откуда вообще берутся новые гены и новые белки, если уже имеющиеся не выпадают?

А как вы поступаете, если вам нужно, например, внести серьёзные правки в имеющийся документ – допустим, вордовский или экселевский – и создать из него нечто новое, но и прежнюю версию вы потерять не хотите? Первым делом вы сохраняете его под новым названием, то есть создаёте копию. И затем работаете с этой копией, периодически сохраняя изменения в ней, и чем дальше, тем больше возникает расхождений с первоначальным файлом. Когда работа будет закончена, новый документ может стать совсем не похожим на исходный, и на первый взгляд можно даже не догадаться, что между ними есть связь.

Оказывается, точно так же действует и эволюция. Идеи о том, что возникновению новых генов предшествует дублирование старых, высказывались ещё в 1930-х – в частности, Джоном Холдейном. Но тогда их невозможно было проверить – ведь до 1950-х было неизвестно, что представляют собой гены. Наблюдая за наследованием и изменением фенотипических признаков, учёные сделали вывод о том, что должны существовать материальные носители наследственной информации. Это немного похоже на обнаружение новых планет или их спутников после внимательного изучения орбит уже известных небесных тел. Но как «вычисленные» планеты нужно ещё увидеть, так и гены ещё только предстояло открыть.

Как именно хранится и передаётся наследственная информация, стало понятнее в 1950-х, после того, как Уотсон и Крик расшифровали структуру ДНК. Вскоре после этого нашлись и подтверждения тому, что участки хромосом, содержащие один или несколько генов, могут удваиваться. Это открывает природе простор для экспериментов – теперь одну из копий гена можно смело изменять и смотреть, не получится ли что-нибудь интересное. Ведь будет и другая, нормально функционирующая копия, которую отбор будет беречь, так что вероятность того, что в организме сразу что-то фатально сломается, меньше.

«Экспериментальная» копия гена может продолжить выполнять ту же функцию, что и раньше, но немного иначе. Но может и взять на себя совершенно новую роль. Наконец, бывает и так, что у гена до дупликации было два или несколько предназначений – в таком случае все копии могут начать эволюционировать, специализируясь, так сказать, в разных областях деятельности.

Приведу только один пример из книги Александра Маркова и Елены Наймарк «Эволюция. Классические идеи в свете новых открытий» (https://chembaby.ru/wp-content/uploads/2017/10/Markov.. ; на всякий случай прикреплю pdf к посту, книжка очень увлекательная, рекомендую). В Африке и Азии есть обезьяны-колобины, или листоеды, они живут в основном на деревьях и питаются почти исключительно листьями. Для этого у них есть сложные многокамерные желудки, а в желудках – симбиотические бактерии, расщепляющие целлюлозу. Из желудка бактерии попадают в кишечник, и там пищеварительные ферменты расщепляют уже их самих, их белки, углеводы и липиды. «Неплохо было бы и РНК переварить и усвоить. В бактериях полно РНК – чего добру пропадать?» — подумала эволюция. Поискала и нашла фермент для расщепления двухцепочечной РНК – часть противовирусной защиты. Но эта противовирусная РНКаза работает в щелочной среде, а в кишечнике у колобин – кислая. Что ж, берём и удваиваем этот ген, одна копия остаётся противовирусной, а другую дорабатываем напильником, пока она не начнёт хорошо расщеплять бактериальную РНК в кислой среде. Дорабатывать пришлось долго: потребовалось девять значимых аминокислотных замен, причём каждая из них снижала исходную функцию, а как следует работать изменённый фермент начал только после всех девяти модификаций. Если бы не удвоение гена, эти девять замен, конечно же, не были бы сохранены отбором – прежде чем их носители научились усваивать РНК своих симбиотических бактерий, их бы выкосили вирусные заболевания.

***

Самый простой вариант дупликации – тандемный, когда дублируется какой-либо фрагмент хромосомы, и по соседству с находящимися в этом фрагменте генами появляются их копии. Но это объясняет не все наблюдаемые явления. Если бы всё ограничивалось этим – то там несколько генов удвоилось, то здесь – эволюция не была бы такой быстрой, и в её ходе реже случались бы масштабные сдвиги.

В 1970-х Сусуму Оно сделал смелое предположение: что, если время от времени происходит удвоение всего генома? Не одного или нескольких генов, а сразу всех. К этому времени уже были некоторые данные, говорящие в пользу этой гипотезы – так, при переходе от низших хордовых к позвоночным размер генома увеличился скачкообразно, в несколько раз. Правда, их было недостаточно, и до триумфа американский генетик японского происхождения не дожил, скончавшись в 2000 г. Но в последние десять-пятнадцать лет полногеномные дупликации считаются доказанным фактом.

Например, в эволюционной линии позвоночных удвоение всего генома, по-видимому, произошло дважды – первый раз при самом их появлении, второй раз – при переходе от бесчелюстных к челюстноротым. Так что предок всех позвоночных, начиная с рыб, был октоплоидом – у него был не двойной, а восьмерной набор хромосом.

Представьте себе, что в компьютерной игре вам случайно выпал бонус – целая куча ресурсов, из которых можно скрафтить самое разное вооружение, броню, амулеты и в итоге подняться сразу на несколько уровней. Примерно так работает полногеномная дупликация. «Процессор», отвечающий за эмбриогенез позвоночных, из одноядерного стал четырёхъядерным, и благодаря этому они обзавелись продвинутым многокамерным сердцем, замысловатым скелетом, высокоразвитой нервной и выделительной системами и так далее. Как это доказывается, можно почитать, например, здесь: http://paleocircle.ru/index.php?option=com_content.. .

Но ни число хромосом, ни число действующих генов у человека не ровно в четыре раза больше, чем у ланцетника. После полногеномной дупликации гены начинают мутировать, и далеко не все из них становятся материалом для создания новых генов – многие просто оказываются лишними, «замолкают», то есть перестают функционировать и превращаются в псевдогены или могут быть удалены. Происходит перенос генетического материала между хромосомами, запутывающий картину; да и число их может измениться. Наконец, тандемные дупликации никто не отменял.

Немного подробнее о дупликации генов – например, тут: https://elementy.ru/novosti_nauki/432632/U_mechekhvos.. .

***

В царстве растений полногеномные дупликации случались значительно чаще, чем у животных (см. рис. 2). В эволюционной линии, ведущей к камелии китайской, было как минимум два таких эпизода.

Это было подтверждено китайскими учёными, осуществившими в 2018 г. полную сборку (то есть полное прочтение) генома Camellia sinensis var. sinensis. Работа Вэй Чаолина и соавторов называется «Draft genome sequence of Camellia sinensis var. sinensis provides insights into the evolution of the tea genome and tea quality» — «Черновая последовательность генома Camellia sinensis var. sinensis дает представление об эволюции чайного генома и качества чая» (см. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5939082/ или https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1719622115 ; полный текст публикации я также прикреплю к посту). Это исследование во многом аналогично работе «The Tea Tree Genome Provides Insights into Tea Flavor and Independent Evolution of Caffeine Biosynthesis» (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28473262/ ), выполненной международным коллективом учёных годом раньше (о ней мы писали здесь — https://vk.com/wall-47905050_10034 , советую перечитать этот пост, будет понятнее), но в ней рассматривался геном ассамского варианта камелии китайской, и акценты были расставлены несколько иначе. Тем интереснее сравнить.

В качестве объекта исследования Вэй Чаолин и его коллеги выбрали популярный культивар Шучацзао (舒茶早), регистрационный номер GS2002008. Ча – чай, цзао – ранний, а иероглиф 舒 («спокойный», «неторопливый») взят из названия уезда Шучэн городского округа Луань провинции Аньхой, где он был выведен; в этом уезде есть и город Шуча. Это современный культивар, высокоурожайный, холодостойкий, с ранней вегетацией, широко распространённый в Аньхое и Хэнани. Его также выращивают в Чжэцзяне, Шаньдуне, Фуцзяни, Сычуани и других провинциях, общая площадь посадок – около 14 тыс. га; он отличается нежным орхидеевым ароматом, хорошо подходит для производства высококачественного зелёного чая и часто фигурирует в научных работах, посвящённых обмену веществ и/или генетике чайных растений. В данном случае он был выбран из-за относительно низкой гетерозиготности – парные хромосомы Шучацзао почти идентичны, различия составляют 2,7%. Расшифровывать геном таких растений легче.

Размер генома Шучацзао – около 3 Гб, примерно две трети этого объёма занято мобильными элементами. Но чтобы составить точную последовательность нуклеотидов, потребовалось сгенерировать сперва 1325, а на втором этапе ещё 125 Гб «кусочков», сличая которые друг с другом, можно воссоздать полную картину. Секвенирование ДНК всё ещё остаётся непростой и трудоёмкой работой.

Число генов, кодирующих белок, у китайского варианта Camellia sinensis оказалось несколько меньше, чем у ассамского – 33932 против 36951. Но в целом характеристики генома у них довольно близки.

Сравнив более 1500 ортологичных (т.е. произошедших от одного гена в общем предковом организме и сохранивших одну и ту же функцию в процессе эволюции) генов Шучацзао и Юнькана №10, подсчитав различия между ними и исходя из универсальной средней скорости замен (6,5 на десять в минус девятой степени мутаций на одну позицию в год), учёные оценили время расхождения китайского и ассамского вариантов Camellia sinensis в 0,38-1,54 миллиона лет назад. Это кардинально отличается от оценок группы учёных под руководством М.K. Meegahakumbura (см. https://vk.com/wall-47905050_12743 ) — 22,5 тысяч лет. Что лишний раз показывает, что «молекулярные часы» (см. https://biomolecula.ru/articles/sverim-chasy ) дают более чем приблизительные результаты, потому что скорости накопления эволюционных изменений в биомолекулах могут сильно различаться. Цейлонско-китайско-индийско-кенийско-британская коллаборация изучала не гены, кодирующие белки, а ДНК хлоропластов и микросателлиты ядерной ДНК – и получились совсем другие цифры. Но какую методику ни возьми, ясно, что долгоживущие теплолюбивые крупнолистные древовидные ассамские камелии и китайские чайные кусты, короткоживущие, холодостойкие и мелколистные, разошлись задолго до начала употребления чая, и человек к этому непричастен.

Вэй Чаолин и его соавторы также сравнили геном чая с геномом десяти других растений – масличной пальмы, винограда культурного, тополя волосистоплодного, резуховидки Таля, какао, люцерны усечённой, персика обыкновенного, актинидии китайской (киви), кофе и амбореллы волосистоножковой. Из 15224 семейств генов в геноме чая 11128 были общими для всех одиннадцати видов, а 429 – специфичными для чая. Новые копии генов возникли в 1810 семействах генов чая, а 1001 семейство сократилось. Заметно усилены у чая домены цитохрома P450, NB-ARC и TFs, а также семейства генов, кодирующие такие ферменты, как 1-дезокси-d-ксилулозо-5-фосфатсинтаза, (−)-гермакрен-D-синтаза, α-фарнезенсинтаза, изопренсинтаза, гераниллиналоолсинтаза и (−)-α-терпинеолсинтаза. Большинство летучих вкусоароматических соединений чая образуется в результате окисления липидов и каротиноидов, а также на терпеноидном и шикиматном метаболических путях – и вышеназванные ферменты участвуют в этом.

Учёные установили, что чай прошёл на две полногеномных дупликации больше по сравнению с виноградом, с которым этого не случалось с момента так называемого гамма-события – грандиозного увеличения генома у общего предка винограда, киви, кофе, какао, чая и др., представлявшего собой, по всей видимости, не удвоение, а учетверение и состоявшегося около 140 миллионов лет назад; оно создало почву для формирования в этой линии разнообразных свойств, впоследствии порадовавших людей. Одна дупликация произошла примерно 90-100 млн лет назад, до расхождения чая с киви (∼ 80 млн лет назад), вторая – после него, 30-40 млн лет назад. Эти дупликации значительно повлияли на пути синтеза вторичных метаболитов (то есть веществ, которые синтезируются организмом, но не участвуют непосредственно в росте, развитии и размножении; к ним как раз и относятся флавоноиды, алкалоиды и небелковые аминокислоты), в частности, катехинов. Например, из двадцати двух генов SCPL – серинкарбоксипептидазоподобных ацилтрансфераз – четыре были сгенерированы при последней полногеномной дупликации. Но более значимыми для эволюции пути катехинов были предпоследняя полногеномная дупликация и частичные дупликации, состоявшиеся сравнительно недавно – от 2 до 25 миллионов лет назад. В это время возникли новые гены SCPL, DFR – дигидрофлавонолредуктазы, CHS – халконсинтазы. Почему так важны SCPL? К этой группе относятся ферменты, необходимые для синтеза галлированных катехинов – эпикатехингаллата (ЭКГ) и эпигаллокатехингаллата (ЭГКГ), которые составляют до 80% всех катехинов в верхушечных почках чайного побега и проявляют наиболее высокую антиоксидантную активность, с которой связаны многие предполагаемые полезные свойства чая. В чае не просто больше генов SCPL, чем в других растениях этой эволюционной линии (у винограда – 11, у резуховидки Таля – 19, у тополя – 8), большинство из них специфичны и существенно отличаются от генов этого семейства у других растений. Камелия китайская усиленно нарабатывала эти ферменты – естественно, начиная с дублирования их генов.

Галлированные катехины, накапливающиеся в молодых чайных листьях и почках, находятся там в виде мономеров, тогда как во многих других растениях они присутствуют в конденсированных, полимерных формах. Процесс полимеризации проантоцианидинов пока недостаточно изучен, но установлено, что в люцерне LAR – лейкоантоцианидинредуктаза – препятствует этому процессу, превращая 4β-(S-цистеинил)-эпикатехин, «строительную единицу» полимеризованных проантоцианидинов обратно в эпикатехин. И в молодых побегах чая наблюдается высокая экспрессия генов LAR. А вот в корнях, цветках и плодах чая она ниже – и в них мономерных галлированных катехинов меньше, а полимеризованных проантоцианидинов больше.

Регуляция биосинтеза катехинов весьма сложна. В ней принимают участие различные семейства транскрипционных факторов (TFs) — MADS box, R2R3-MYB, bHLH TFs и т.д. Они повышают или понижают экспрессию генов CHS, DFR, SCPL и других ферментов катехинового пути. Часть факторов транскрипции – WRKY, C2H2, C3H, NAC, ERF – тесно связаны с реакцией на биотический и абиотический стресс. Поэтому синтез катехинов, выполняющих защитную и адаптационную функцию, изменяется в зависимости от условий окружающей среды. Такие механизмы (касающиеся не только катехинов, но и других веществ, вносящих вклад во вкус и аромат чая) лежат в основе терруарности и миллезимности чая, столь привлекательных для гурманов. Чаи из сырья с одного и того же культивара, прошедшего одну и ту же обработку, могут сильно отличаться друг от друга, потому что отличались почвы, климат, биоокружение – и это чрезвычайно увлекательно.

В ходе этой работы был также впервые идентифицирован ген теанинсинтетазы – фермента, синтезирующего L-теанин, главную свободную аминокислоту чая, из глутаминовой кислоты и этиламина (о биосинтезе L-теанина и его роли в жизнедеятельности чайных растений мы говорили здесь — https://vk.com/wall-47905050_18098 ). Теанинсинтетаза, а точнее, две разных теанинсинтетазы были выделены и изучены уже давно, но до сих пор оставалось неясным, какие именно гены их кодируют – и вот наконец один из таких генов удалось найти. Как и следовало ожидать, это ген из семейства глутаминсинтетаз – синтез глутамина аналогичен синтезу теанина, только вместо этиламина используется аммиак, да и аминокислотные последовательности теанинсинтетаз на 97-99% совпадают с аминокислотными последовательностями глутаминсинтетаз. Это ещё один пример эволюции генов и кодируемых ими ферментов, не такой остроумной, как с обезьяньими РНКазами, зато очень логичной. Глутаминсинтетазы очень важны для фиксации азота растениями, и после накопления их копий и формирования различных их вариантов появилась возможность видоизменить часть их генов так, что кодируемые ими ферменты стали проявлять большее сродство к этиламину, чем к аммиаку – и начали синтезировать аминокислоту, которая оказалась очень удобным резервуаром и азота, и коротких углеродных фрагментов и средством доставки их от корней к листьям.

В заключение авторы работы вкратце касаются биосинтеза кофеина. Они подтверждают вывод коллег, изучавших геном Юнькана №10, о том, что N-метилтрансферазы (NMT), метилирующие ксантозин, пока он не превратится в кофеин, эволюционировали у чая, кофе и какао независимо друг от друга, и подчёркивают, что бóльшая часть генов NMT возникла после самых последних дупликаций (это хорошо видно на рис. 5 — большинство зелёных «ёжиков» расположены в самом низу шкалы).

Не знаю, как вам, а мне читать об эволюции генов, ферментов и метаболических путей очень интересно. Это как увидеть секрет фокуса, те механизмы, которые обеспечивают то, что непосвящённому кажется чудом.

Рис. 1. Схема тандемной и полногеномной дупликации.


Рис. 2. Полногеномные дупликации в эволюции эукариот.


Рис. 3. Расширение (зелёный цвет) и сокращение (красный цвет) семейств генов при эволюции масличной пальмы, винограда культурного, тополя волосистоплодного, резуховидки Таля, какао, люцерны усечённой, персика обыкновенного, чая, актинидии китайской (киви), кофе и амбореллы волосистоножковой. По оси абсцисс – миллионы лет назад.


Рис. 4. Доказательство двух удвоений генома чая по сравнению с виноградом. Синее – геном винограда, красные штрихи – гены чая, соответствующие генам винограда.


Рис. 5. Эволюция генов, связанных со вторичными метаболитами, у семи видов растений. Каждый случай дупликации обозначен значком. По оси ординат – миллионы лет назад. Красные звёздочки в верхней части схемы – полногеномные дупликации.


Рис. 6. Схема биосинтеза катехинов чая.


Рис. 7. Регуляция биосинтеза катехинов. Шестиугольники – гены, связанные с биосинтезом кофеинов, кружочки – транскрипционные факторы, линии – установленные корреляции экспрессии.


Рис. 8. Филогенетическое дерево N-метилтрансфераз у чая, какао и кофе.

16 сентября 2022 г.
Источник: Самая домашняя чайная «Сова и Панда» https://vk.com/club47905050
Антон Дмитращук https://vk.com/id183549038


Понравилась статья? Поделись с друзьями!


Обсуждение закрыто.