Аньцзи Бай Ча: немного о молекулярных основах чайного альбинизма
Аньцзи Бай Ча (安吉白茶), Белолистный чай из Аньцзи – современный сорт зелёного чая из уезда Аньцзи, провинция Чжэцзян. В 1970-х гг. около деревни Даси посёлка Тяньхуанпин было обнаружено старое чайное дерево с необычной светлой окраской молодых побегов. В 1982 г. начались масштабные работы по вегетативному размножению материала с этого дерева, а в 1991 г. была создана первая партия чая с рабочим названием Юй Фэн (玉凤) – «Нефритовый Феникс», получившая высокую оценку экспертов. В конце 1990-х изучение свойств этой разновидности и отработка технологии были завершены, и в 2000 г. новый культивар был зарегистрирован под названием «Бай Е И Хао» (白叶一号) – «Белолистный номер один», а готовый продукт получил название Аньцзи Бай Ча. С 2004 г. название Аньцзи Бай Ча является географически защищённым.
За двадцать лет объёмы производства Аньцзи Бай Ча многократно выросли и сейчас составляют около 2000 тонн в год. Аньцзи Бай Ча стал одним из самых известных зелёных чаёв не только Чжэцзяна, но и всего Китая. Кроме Чжэцзяна, Бай Е И Хао культивируют в уезде Лиян округа Чанчжоу провинции Цзянсу, в Яньхэ-Туцзяском автономном уезде округа Тунжэнь провинции Гуйчжоу и др. Короткое время сбора и сравнительно невысокая урожайность с лихвой компенсируются выдающимся вкусом и ароматом чая. Цены на чай из сырья с белолистных и желтолистных культиваров (Бай Е И Хао – самый популярный из них, но далеко не единственный) достаточно высоки, а интерес к такому чаю постоянно растёт, поэтому в его производстве отстающие регионы видят возможность преодоления бедности.
Бай Е И Хао является термочувствительным полуальбиносом. Первые почки и начинающие формироваться листья имеют жёлто-зелёную окраску. На стадии почка+лист – почка+2 листа при температуре ниже 20°С листья приобретают характерный «нефритовый» цвет – бледно-зеленоватый или бледно-желтоватый, не белоснежный, но гораздо светлее, чем у «нормального» чая, при этом центральная жила листа и близкие к ней участки боковых жил становятся тёмно-зелёными, образуя контрастный рисунок. При дальнейшем развитии побега, а также при температуре выше 22°С листья становятся нежно-зелёными, привычного для весенних чайных побегов цвета (см. фото 5 и 6). Для высококачественного Аньцзи Бай Ча собирается сырьё на стадии побеления, поэтому и срок его сбора короток – обычно это примерно две недели с середины марта до начала апреля.
Чай из сырья с Бай Е И Хао, собранного на стадии побеления, отличается необычным химическим составом. Он содержит меньше хлорофилла (см. фото 6), чем и объясняется окраска, но это на вкус, конечно, не влияет – хлорофилл нерастворим и не вносит вклад во вкус и аромат чая. Важно другое: Аньцзи Бай Ча содержит существенно меньше кофеина и других пуриновых алкалоидов по сравнению с обычными зелёными чаями; существенно меньше полифенолов – всего лишь 10-14%; значительно больше аминокислот (прежде всего, теанина, а также аллотреонина, глицина, серина, триптофана, цитруллина, глутамина, аланина, валина и пролина) – до 6-7, а в некоторых случаях до 10%, что в разы выше, чем в обычных зелёных чаях. Это делает вкус Аньцзи Бай Ча освежающим, сладковатым, с выраженным умами и с минимальной терпкостью и горечью.
Процессы, происходящие в листьях белолистных и желтолистных культиваров на стадиях побеления и позеленения, и механизмы их регуляции привлекли большое внимание учёных. Состав листьев Бай Е И Хао тщательно изучен на транскриптомном (совокупность РНК), протеомном (совокупность белков) и метаболомном (совокупность низкомолекулярных веществ) уровнях, в конце поста я приведу ссылки на соответствующие научные исследования, а здесь хочу остановиться лишь на нескольких моментах, хорошо показывающих, насколько сложной биохимической фабрикой является чайный лист.
Хлорофилл содержится в тилакоидах – мембранных структурах, собранных в стопки-граны внутри хлоропластов – органелл, отвечающих в растительных клетках за фотосинтез. При снижении биосинтеза хлорофилла – например, при длительном нахождении в темноте – хлоропласты обратимо трансформируются в слабоокрашенные этиопласты. На первой, «жёлто-зелёной» стадии хлоропласты Бай Е И Хао имели типичное строение с хорошо выраженными тилакоидами, собранными в граны; на стадии побеления граны исчезли, в хлоропластах осталось лишь несколько тилакоидов, часть хлоропластов превратилась в этиопласты; после повышения температуры, на стадии позеленения число хлоропластов увеличилось, и их структура вернулась к норме (см. фото 7).
При протеомном анализе было обнаружено больше шестидесяти белков, экспрессия которых существенно изменяется в зависимости от стадии развития побега. Эти белки участвуют в процессах гликолиза и энергетического обмена, метаболизме углерода, азота и серы, фотосинтезе, процессинге белка и РНК и стрессовых реакциях.
Дифференциально экспрессируемые белки энергетического обмена были представлены фосфоглицераткиназой и енолазой. Фосфоглицераткиназа катализирует обратимый перенос фосфатной группы от 1,3-дифосфоглицерата к АДФ, в результате чего образуется 3-фосфоглицерат и АТФ. Экспрессия этого фермента увеличивается на стадии побеления, что может указывать на увеличение производства энергии для различных защитных процессов, связанных с холодовым стрессом. Экспрессия енолазы, катализирующей переход 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват, снижалась, но её активность при этом сохранялась – по-видимому, работа енолазы контролируется на посттранскрипционном уровне для того, чтобы интенсивность окисления глюкозы не снижалась при низких температурах.
Белки, участвующие в обмене азота и серы, были идентифицированы как S-аденозилметионинсинтетаза, глутаминсинтетаза и метилентетрагидрофолатредуктаза, их содержание на «белой» стадии было снижено. S-аденозилметионинсинтетаза катализирует образование S-аденозилметионина из L-метионина и АТФ. S -аденозилметионин выступает в роли универсального донора метила в многочисленных биологических реакциях. В частности, он является донором метила при образовании протохлорофиллида из Mg-протопорфирина, а протохлорофиллид – непосредственный предшественник хлорофилла, и его недостаток – одна из причин побеления листьев. А ещё S-аденозилметионин является донором метила при биосинтезе кофеина, и его недостаток – одна из причин низкого содержания кофеина в Аньцзи Бай Ча; как видите, у таких непохожих соединений, как кофеин и хлорофилл, есть общие ключевые пункты в метаболизме. Метилентетрагидрофолатредуктаза – важный фермент метаболизма метионина, а метионин требуется на начальных стадиях биосинтеза кофеина. А глутаминсинтетаза катализирует образование глутамина из глутаминовой кислоты и аммония, этот фермент важен для защиты растения от избытка аммония. При недостатке глутаминсинтетазы глутаминовая кислота может направляться на синтез теанина, в котором и аккумулируется лишний азот. С протеомной точки зрения, это логичное предположение, однако анализ метаболомики его не подтверждает: содержание глутамина на стадии побеления, наоборот, растёт, и он может превращаться и в глутаминовую кислоту, и в аланин, при декарбоксилировании которого образуется этиламин. Глутаминовая кислота и этиламин нужны для синтеза теанина, но о биосинтезе теанина я лучше напишу отдельный пост.
Рибулозобисфосфаткарбоксилаза (Рубиско) – важнейший фермент листьев растений, непосредственно отвечающий за связывание углекислого газа при фотосинтезе; можно сказать, что именно Рубиско осуществляет переход неорганической материи в органическую. На стадии побеления снижается содержание интактных больших субъединиц Рубиско и увеличивается содержание их фрагментов. Снижение фотосинтетической активности приводит к меньшей выработке углеводов. Уровень фруктозы и глюкозо-1-фосфата снижен на протяжении «белой стадии», уровень глюкозы снижен в начале «белой» стадии и повышается к её концу, что, по-видимому, отражает усиление гидролиза резервных полисахаридов. Дефицит углеводов приводит к активации альтернативных путей получения энергии. В результате, бóльшая часть фосфоенолпирувата направляется в цикл трикарбоновой кислоты и окисляется в нём, и меньшая – на путь шикимовой кислоты. Этим и объясняется снижение продукции полифенолов – необходимый для их синтеза пируват «сжигается» (см. фото 8).
Нужно учитывать и то, что глутаминовая кислота используется в биосинтезе хлорофилла – она находится в самом начале цепочки из двадцати реакций, приводящих к образованию хлорофилла. И при снижении синтеза хлорофилла может возникать избыток глутамата, который можно направить на синтез теанина.
На стадии побеления снижается экспрессия белков теплового шока HSP60 и HSP70, а HSP70 необходим для правильного развития хлоропластов. Фактор инициации 4A (eIF-4А) играет важную роль в инициации трансляции у эукариот, снижение его содержания на стадии побеления может приводить к нарушению биосинтеза новых белков – в том числе и ферментов, о которых говорилось выше.
Ранний фотоиндуцируемый белок (ELIP), член семейства хлорофилл-связывающих белков, участвует в сборке или ремонте фотосинтетического механизма во время раннего развития хлоропластов. Его экспрессия индуцируется многими стрессовыми факторами. Нарушение структуры хлоропласта на стадии побеления приводит к снижению фотосинтетической способности, и в этих условиях избыток световой энергии может привести к образованию токсичных соединений – в частности, свободных радикалов. Накопление ELIP может защитить чайное растение от повреждения ими.
Изофлавоновая редуктаза участвует в синтезе изофлавоновых фитоалексинов. Из-за снижения биоснитеза полифенолов продукция изофлавоновых фитоалексинов уменьшается, поэтому уровень экспрессии изофлавоновой редуктазы на «белой» стадии снижается – она просто не нужна.
И это лишь часть обнаруженных различий. Регуляция описанных процессов весьма сложна: выявлены 8790 генов, экспрессия которых изменяется при побелении побега Бай Е И Хао, и 9476 генов, экспрессия которых изменяется при его обратном позеленении. Транскриптомный анализ не только подтверждает выводы протеомных и метаболомных исследований, но и дополняет их. Так, заметные различия выявлены в содержании каротиноидов на разных стадиях. Каротиноиды – терпеноиды, являющиеся производными ациклического углеводорода ликопина; это пигменты жёлтого, оранжевого и красного цвета; они принимают участие в фотосинтезе, а также служат предшественниками абсцизовой кислоты – важного гормона растений. Содержание ликопина снижалось по мере развития побега, содержание лютеина повышалось, а содержание бета-каротина достигало максимума на «белой» стадии, а после позеленения падало. Это связано с разной степенью экспрессии генов, кодирующих ликопин-бета-циклазу (превращающую ликопин в гамма-каротин, из которого затем образуются бета-каротин и зеаксантин) и ликопин-эпсилон-циклазу (превращающую ликопин в дельта-каротин, из которого затем образуются альфа-каротин и лютеин). Для вкуса и аромата зелёного чая каротиноиды не очень важны, а вот при окислительной ферментации в процессе производства красного чая каротиноиды распадаются с образованием соединений терпенового ряда, влияющих на вкус и аромат чая.
Таким образом, при развитии побега Бай Е И Хао имеет место не только снижение и последующее восстановление синтеза хлорофилла, приводящее к изменению окраски листьев, но и глубокая перестройка метаболических путей, при внимательном изучении которых обнаруживаются связи между такими, казалось бы, несхожими веществами, как хлорофилл, алкалоиды, полифенолы и теанин.
Почему мне захотелось написать этот пост, на две трети состоящий из того, во что большинство читателей не станут вникать хоть немного?
Во-первых, не менее сложные процессы происходят при развитии побегов зеленолистных чайных растений. У белолистных и желтолистных культиваров эти изменения более наглядны, но и у обычного чая содержание кофеина, аминокислот и полифенолов изменяется в зависимости как от стадии развития побега, так и от внешних условий. Химический состав чайного сырья из одного и того же сада, собранного в разное время, может различаться не менее сильно, чем состав сырья с разных культиваров и из разных мест. Поэтому у интереса к чаю, собранному в определённое, оптимальное для этого сорта время, и у высокой цены такого чая есть вполне объективные основания. У многих сортов зелёного чая высоко ценится предъясностный чай, и дело тут не в традициях, не в маркетинге, не в том, что появления этого чая долго ждут. Он фактически – биохимически! – отличается от чая позднего сбора. Аньцзи Бай Ча – прекрасный тому пример.
Во-вторых, мне хотелось напомнить, что кроме мира, в котором люди предпочитают не искать объяснений, а списывать всё на мистические, принципиально непознаваемые «энергии», есть и другой мир – мир научного поиска, интеллекта, изобретательности и дерзости. И достижения этого мира впечатляют.
1. Молодые побеги Бай Е И Хао, «белая» стадия.
2. Юный чайный сад Бай Е И Хао в Гуйчжоу. Жёлтые листки – клейкие ловушки для насекомых-вредителей. Вероятно, это органическая плантация.
4. «Чайное дно» Аньцзи Бай Ча.
5. Побег Бай Е И Хао на трёх разных стадиях развития.
6. Листья Бай Е И Хао и содержание хлорофилла в них на разных стадиях развития: YG – «жёлто-зелёная» стадия, WI – раннее побеление, WII – позднее побеление, G –позеленение.
7. Микрофотографии клеток листьев Аньцзи Бай Ча на трёх стадиях развития: a, b – «жёлто-зелёная» стадия, c, d – стадия побеления, e, f – стадия позеленения. Ch – хлоропласт; Et – этиопласт; Th – тилакоид; Gr – грана; ST – строма; SG – крахмальная гранула.
8. Схема активности метаболических путей на разных стадиях развития Бай Е И Хао. Слева направо на цветных полосках – стадии: YG – «жёлто-зелёная» стадия, WI – раннее побеление, WII – позднее побеление, G –позеленение. Цветом обозначена концентрация метаболитов, цветная шкала – десятично-логарифмическая, то есть между «1» и «2» разница в 10 раз.
Источники — http://www.baicha.cn/html/2217.html , http://www.baicha.cn/html/2882.html , https://www.sohu.com/a/212586240_99973398 , http://dangjian.people.com.cn/n1/2020/0420/c117092-31.. , https://baijiahao.baidu.com/s?id=1640484551044781425.. , https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/14620316… и др.
Транксриптомный анализ — https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5015330/ .
Протеомный анализ — https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3162873/ .
Метаболомный анализ — https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4622044/ .
01 июля 2020 г.
Источник: Самая домашняя чайная «Сова и Панда» https://vk.com/club47905050
Антон Дмитращук https://vk.com/id183549038